[发明专利]用改变乌头酸酶调控元件的细菌发酵生产L-赖氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于氨基酸发酵领域，具体而言，本发明涉及发酵生产L-赖氨酸的方法及其衍生的方法和应用，和可以用在这些方法和应用中的细菌等。 

背景技术

通过产L-赖氨酸的细菌(如，埃希氏菌属的大肠杆菌和棒杆菌属的杆状细菌)发酵来生产L-赖氨酸已经得到了产业化应用。这些细菌，可以是从自然界分离的细菌，也可以是通过诱变或基因工程改造获得的细菌，或者两者兼而有之。当前的文献报道中，通过基因工程改造的注意力主要集中在pnt、dap及ppc等基因上，未见为了L-赖氨酸生产而关注编码乌头酸酶(如，乌头酸酶A)的基因的调控元件。 

乌头酸酶是三羧酸循环中的一个酶，该酶催化两步化学反应，分别为柠檬酸转化为乌头酸以及乌头酸转化为异柠檬酸。目前已知在埃希氏菌中，acnA基因(其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示)编码乌头酸酶A，但是可能是由于其代谢距离最终的L-赖氨酸产物太远，中间代谢分支太多且复杂，而在L-赖氨酸发酵中一直未引起人们的重视。 

本发明人经过长期研究和实践，尤其凭借了一些运气，偶然发现acnA基因的调控元件的改造能够有助于提高L-赖氨酸的产量；然而，现有技术要么通过增加拷贝和/或定点突变导入表达量和/或酶活性提高的有益的酶基因，要么通过敲除不利的基因以使之酶活性和/或表达量消失，但是与之不同的是，本发明人发现，acnA基因的调控元件不能简单地提高或敲除，尤其是敲除后acnA基因的不表达使得细菌生长困难，难以实际应用，因此开发了新的针对acnA基因的调控元件的方法，以此来提高L-赖氨酸的产量，而且该方法与现有改造的大量高产L-赖氨酸的细菌的染色体改造位点没有冲突，可以叠加提高的效果，从而在实践上可用于细菌发酵生产L-赖氨酸。 

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供新的发酵生产L-赖氨酸的方法及其相关的方法， 包括相对于未改造细菌提高L-赖氨酸的发酵生产量的方法，改造的细菌在发酵生产L-赖氨酸中的应用，改造的细菌在相对于未改造细菌提高L-赖氨酸的发酵生产量的应用，和/或，改造细菌的方法等。另外，本发明还提供了可以用于上述方法中的多核苷酸、载体和/或细菌等。 

具体而言，在第一方面，本发明提供了发酵生产L-赖氨酸的方法，其包括： 

(1)改造细菌染色体上acnA基因的野生型的调控元件，使改造获得的细菌的乌头酸酶A的表达量降低但不消失；和， 

(2)用步骤(1)改造而得到的细菌发酵生产L-赖氨酸。 

在本文中，术语“改造”指的是是相应被改造的对象发生变化，从而达到一定的效果。改造位于染色体上的调控元件的频度远小于改造位于染色体上的基因的频度，但是两者进行改造的技术手段基本一致，包括但是不限于，诱变、定点突变、和/或同源重组，优选是后两者。这些技术手段广泛记载于分子生物学和微生物学文献中，有许多甚至已经商品化了。在本发明的具体实施方式中，根据同源重组的原理，采用Addgene公司商品化的pKOV质粒系统来进行改造，将未改造细菌染色体上acnA基因的野生型的调控元件，改造成能够使改造获得的细菌的乌头酸酶A的表达量降低但不消失的新的调控元件。因此，在本文文中，优选改造是通过同源重组进行的改造。 

本发明人经过长期研究发现，使得acnA基因所编码的乌头酸酶A的表达量消失，将造成细菌本身生长困难，甚至无法生长/繁殖。因此，本发明的“改造”要相对于未改造的细菌，使改造获得的细菌的乌头酸酶A的表达量降低但不消失，优选使改造获得的细菌的乌头酸酶A的表达量降低20％～95％，更优选降低50％～90％，如降低65％、70％或80％。 

相应地，本发明还提供了其他应用或方法。例如，在第二方面，本发明提供了提高L-赖氨酸的发酵量的方法，其包括： 

(1)改造细菌染色体上acnA基因的野生型的调控元件，使改造获得的细菌的乌头酸酶A的表达量降低但不消失；和， 

(2)用步骤(1)改造而得到的细菌发酵产生L-赖氨酸。