[发明专利]一种酶法快速定量检测heparosan的方法

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种酶法快速定量检测heparosan的方法。

（二）背景技术

Heparosan，又称N-acetylheparosan，（-GlcUA-1,4-GlcNAc-1,4-）_n,是E.coli O10:K5:H4（简称E.coli K5）等菌株荚膜中多糖骨架的二糖重复单位，可作为肝素和硫酸乙酰肝素的生物合成前体。目前heparoan的检测方法主要有硫酸-咔唑法、干重法，干重法需要将细菌发酵液进行分离、醇沉、烘干、称量等步骤，最后获得的粗多糖中含有较多杂质（蛋白质、其他多糖等），测量精度差。而硫酸咔唑法是适用范围比较广的一种糖醛酸含量的测定方法，多糖含量的测定也是通过先测定多糖中糖醛酸的含量，再换算成多糖的含量，该方法目前广泛应用于软骨素、透明质酸、肝素、硫酸乙酰肝素、黄瓜多糖、果胶多糖等酸性多糖中糖醛酸含量的测定，该测定方法易受试剂或样品中杂质（葡萄糖、盐、铁离子等）的干扰，存在操作繁琐、重现性差、干扰因素多、专一性差等缺点。

而选定合适的酶，进行酶法检测具有快速、简便、专一性强和高精密度等优点，目前在实际应用中越来越广。HeparinaseⅢ酶（EC4.2.2.8）为黄杆菌（flavobacterium heparinum）中提取的细菌肝素酶，能特异性裂解N-硫酸化或N-乙酰化葡萄糖胺（GlcNSO₃或GlcNAc）与葡萄糖醛酸之间的糖苷键。目前研究者已证明heparinaseⅢ酶能降解硫酸乙酰肝素，但还未有报道将heparinaseⅢ酶应用于heparosan或硫酸乙酰肝素含量检测。

（三）发明内容

本发明的目的是为了提供一种的酶法快速定量检测heparosan的方法，该方法与硫酸咔唑法、干重法相比具有专一性强，精度高、重现性好等优点。

本发明采用的技术方案是：

一种酶法快速定量检测heparosan的方法，所述方法包括：

（1）取待测样品，溶于pH7.0~7.5的缓冲液中配制成样品溶液，混匀，25~35℃下平衡0.1~10min，加入足量Heparinase III酶，混匀，25~35℃水浴0.1~3h，加入HCl溶液，离心混匀，取上清液进行紫外分光光光度计检测，以未进行酶反应的样品为空白对照，读出样品的吸光度值A_235nm；所述待测样品可以是提取后的heparosan样品，也可以是含有heparosan的粗品或E.coli K5发酵上清液等；

（2）配制梯度浓度的heparosan标准品溶液，按照步骤（1）方法进行反应和检测，绘制吸光度值与底物浓度的标准曲线；

（3）对照标准曲线，根据样品吸光度值A_235nm，获得样品溶液中heparosan浓度值，换算得到样品中heparosan含量。

所述步骤（1）缓冲液组成如下：Tris HCl10~50mM，NaCl40~80mM，CaCl₂1~4mM，牛血清蛋白0.005~0.02%（w/w），溶剂为水，pH7.0~7.5。

对酶反应体系进行优化，所述方法如下：

（1）取待测样品，溶于缓冲液A中配制成样品浓度1~500g/L的样品溶液（样品为提取后的heparosan样品时，样品浓度为1~10g/L为宜，样品为含有heparosan的粗品时，样品浓度可为100~500g/L，优选为300~500g/L），取0.6mL样品溶液，混匀，25~35℃下平衡0.1~10min，加入Heparinase III酶液0.05mL，混匀，25~35℃水浴0.1~3h，加入50mMHCl溶液2.35mL，离心混匀，取上清液进行紫外分光光光度计检测，以未进行酶反应的样品为空白对照，读出样品的吸光度值A_235nm；所述缓冲液A组成如下：Tris HCl20mM，NaCl50mM，CaCl₂4mM，牛血清蛋白0.01%，溶剂为水，pH7.5；所述Heparinase III酶液由Heparinase III酶溶于缓冲液A制得，酶液单位酶活大于165U/mL;

（2）配制梯度浓度的heparosan标准品溶液，按照步骤（1）方法进行反应和检测，绘制吸光度值与底物浓度的标准曲线；

（3）对照标准曲线，根据样品吸光度值A_235nm，获得样品溶液中heparosan浓度值，换算得到样品中heparosan含量。