[发明专利]一种替代检测猪瘟兔化弱毒株的兔体热反应的新方法

说明书

技术领域

本发明涉及兔体热反应测定方法，以替代家兔测定猪瘟兔化弱毒疫苗能否引起家兔产生热反应是否合格的方法，克服了因家兔个体差异和环境因素导致结果的偏差。

背景技术

常规的兔体热反应测定方法是选取体重为1.5～3.0kg的健康家兔2只，将猪瘟兔化弱毒疫苗150倍稀释后从家兔耳缘静脉接种到体内，每只1ml，家兔接种后，上、下午各测体温1次，48小时后，每隔6小时测体温1次，定型热的兔子潜伏期24～48h，体温上升呈明显曲线，超过常温1℃以上，至少有3个温次，并稽留18～36h；当2只家兔均呈定型热反应(++)，或1只兔呈定型热反应(++)、另1只兔呈轻热反应(+)时，疫苗判为合格；此方法因家兔个体差异、环境因素、人为操作因素造成假阳性和假阴性，导致检测结果的偏差，最终导致猪瘟兔化弱毒疫苗质量的不稳定。

对国内最新相关研究的进展和成果进行检索后结果表明：猪瘟兔化弱毒株除用上述方法进行兔体热反应测定，还有实时荧光定量PCR,此方法有相关机构正在研究，但此方法成本高，对设备和人员素质要求较高，从研发到推广尚需时日；而用免疫荧光检测猪瘟兔化弱毒株的兔体热反应的新方法经国内范围内的检索查证，国内未见与本项目研究内容相同的成果公开报道。

本发明构思是将已知兔体热反应的猪瘟兔化弱毒疫苗接种PK-15细胞，培养5天后，用免疫荧光检测猪瘟病毒的半数组织感染量（TCID₅₀）,得到兔体热反应和半数组织感染量之间的关系，用猪瘟病毒的TCID₅₀替代家兔感染量，结果表明采用猪瘟病毒的TCID₅₀替代家兔感染量，本检测方法具有极强的稳定性与可重复性。

发明内容

本发明的目的在于：提供得的用免疫荧光检测猪瘟兔化弱毒株的兔体热反应的新方法，替代了用家兔进行兔体热反应的测定，确定猪瘟兔化弱毒疫苗是否合格，既节省时间又节约人力。

本发明目的是这样实现的：一种替代检测猪瘟兔化弱毒株的兔体热反应的新方法，将猪瘟兔化弱毒株2倍梯度稀释，然后接种于PK-15细胞，在37℃含5%的CO₂培养箱中培养5日进行免疫荧光法的测定，Reed-Muench法计算病毒价，即为TCID₅₀；

其中病毒的稀释：

将空白的96孔板中加入100μl的无血清的MEM，然后将已知兔热反应的猪瘟兔化弱毒株用移液器吸取100μl加入96孔板的第1排，每个稀释度做8重复，用移液器反复吹打混匀，从第1排吸取100μl加至第2排进行2倍梯度稀释，如此稀释至第11排，从第11排吸取100μl弃去，第12排为阴性对照；

其中PK-15细胞的制备:

将生长致密的PK-15单层细胞用D-Hanks洗2次，加入浓度为0.25%的EDTA～胰酶消化细胞，消化完毕后，加入适量的培养基用吸管轻轻吹打，使细胞分散成单个细胞，取其中100μl，加900μl的D-Hanks液，混匀后滴于血细胞计数板上，按白细胞计数法，于低倍镜下计数四角的4个大方格内的细胞，计数完毕后将细胞稀释到约1.0×10⁵个/ml，加入96孔板内，加细胞顺序从第12排阴性开始，从使每孔细胞数约为1.0×10⁴个，然后置于37℃、5%的CO₂培养箱中培养，培养5天后备用；

其中间接免疫荧光法的检测:

1）细胞的固定，将培养5天的接种猪瘟兔化弱毒株的PK-15细胞板取出，将病毒液倒入废弃桶中，每孔加入200μl的PBST洗6次后，每孔加入100μl的4%福尔马林，固定10分钟；其中PBST是0.1mol/L的PBS中加入0.05%的吐温20配制所得；

2）一抗反应，固定完毕，每孔加入200μl的PBST洗6次，以1%PBA 1000倍稀释一抗，每孔加入50μl的一抗，置于室温反应1小时后,每孔再加入200μl的PBST洗6次；其中1%PBA，即PBS中加入1%BSA配制所得；

3）二抗反应，以1%PBA1000倍稀释FITC标记的兔抗猪的IgG二抗，每孔加入50μl的FITC标记的兔抗猪的IgG二抗，置于室温反应1小时，每孔加入200μl的PBST洗4次；

4）毒价的判定，将PBST倒干后，再加入50μlPBST，并于倒立于荧光显微镜下，判读猪瘟兔化弱毒株毒价，以Reed-Muench方式计算病毒毒价，以TCID₅₀/ml表示，测得兔体热反应和TCID₅₀之间的关系；