[发明专利]一种快速简便富集微量动物组织线粒体DNA的方法

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种快速简便富集微量动物组织线粒体DNA的方法。

（二）背景技术

二十世纪中叶，随着DNA双螺旋模型的揭示和生物遗传密码的破解，生物学研究逐渐进入分子水平，加上核酸序列测定以及聚合酶链式反应（PCR）技术的发明和日趋成熟，基于DNA片段的扩增和序列分析的分子鉴定方法越来越受到人们的重视。线粒体DNA作为一种核基因组外的遗传信息携带者，由于其拷贝数量大、进化速度快、没有同源重组、分子结构稳定等特性受到分子鉴定学家们的青睐，特别适合于物种鉴定、个体分析以及古生物研究等方面。传统的线粒体DNA富集方法主要是依靠分级超速离心先分离出线粒体，再针对线粒体提取DNA，不仅样品需求量大且过程繁琐。目前最常用的方法是利用CTAB或者SDS法同时提取细胞核DNA和线粒体DNA，利用线粒体特异性引物扩增目的片段（如动物条形码标签cox1），然而动物组织样品预处理中常常用到蛋白酶K消化很费时；此外硅胶膜离心柱法也是目前常用的商品化方法，缺点在于成本太高，不适合大规模样品的分析。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种线粒体DNA富集方法，起始组织用量少（最低可为10mg），富集出的DNA可以作为后续PCR扩增分析的可靠模板。

本发明采用的技术方案是：

一种快速简便富集微量动物组织线粒体DNA的方法，所述方法包括：

（1）取动物组织样品（最低10mg），加入适量提取缓冲液，置于1.5mL离心管中，漩涡振荡器混合1min，得混合液A；所述裂解缓冲液为本领域常规用于组织提取的缓冲液；如果是较硬的动物组织如表皮、肌肉等，则需尽可能切成小块，置于研钵中，加入液氮研磨成粉末状，再置于离心管中进行提取；如果较软的组织如幼虫、胚胎、肝脏、神经等，则不需要进行研磨；

（2）混合液A加入2倍体积碱性裂解液，颠倒混合30sec，冰浴5min，得混合液B；所述裂解缓冲液为本领域常规用于组织裂解的碱性裂解液；

（3）混合液B加入1/2体积的3M醋酸钾溶液，颠倒混合30sec，冰浴10min，得混合液C；

（4）混合液C加入终浓度25μg/mL的RNase A，37℃温浴1hr后自然冷却至室温，12000×g以上离心10～15min，取上清液1移至新的1.5mL离心管；

（5）上清液1中加入等体积的苯酚（pH8.0），室温混匀5～10min，12000×g以上离心10～15min，取上清液2移至新的1.5mL离心管；

（6）上清液2中加入等体积的苯酚/氯仿体积比1:1的混合液，室温混匀5～10min，12000×g以上离心10～15min，取上清液3移至新的1.5mL离心管；

（7）上清液3中加入等体积的氯仿，室温混匀5～10min，12000×g以上离心10～15min，取上清液4移至新的1.5mL离心管；

（8）上清液4中加入1/10体积的3M醋酸钠和2倍体积无水乙醇，混匀，-20℃放置30min沉淀DNA，取沉淀即为富集的线粒体DNA，溶于适量样品溶解液，-20℃保存备用。所述样品溶解液为本领域常规用于DNA保存的溶解液。

步骤（1）中所述提取缓冲液组成如下：0.1M NaCl，1mM EDTA，10mM Tris-Cl，溶剂为水，pH8.0。

步骤（2）中所述碱性裂解液组成如下：1%SDS，0.2M NaOH，溶剂为水。

步骤（8）中样品溶解液10mM Tris-Cl，溶剂为水，pH8.5。

在对于微量动物样品的分子鉴定分析过程中，可采用上述方法富集线粒体DNA，再按照下述方法进行进一步分析：