[发明专利]拟南芥硝酸盐转运体基因NRT3.1及其编码蛋白与应用

说明书

所属技术领域：

本发明属于植物分子生物学与转基因相关技术领域。具体为拟南芥硝酸盐转运体(Nitrate transporters，NRTs)家族关键基因NRT3.1在低氮胁迫下的反应和作用机理，以及该基因在营养高效植物新品种培育中的应用。

背景技术：

氮是植物必需的营养元素之一，是植物体内蛋白质、核酸、叶绿素、酶等的组成成分。氮素供应不足会影响植物的生长发育，限制农作物的产量；而氮肥施用过量则使氮素利用率下降，不仅造成资源浪费，而且引起环境污染。通过挖掘植物自身遗传潜能，克隆耐低氮和氮素营养高效的基因，并利用转基因技术培育氮素利用效率提高的新品种是解决这一问题的重要途径之一。

拟南芥(Arabidopsis thaliana)属十字花科、芸薹属植物，它不仅是第一个完成基因组序列测定的模式植物(Athanasios Theologis.et al.，Nature，2000，408：791-826)，而且具有植株小，生长周期短，种子数量多，基因组小且易于进行遗传转化，自花授粉而又易于杂交等优点。因此在植物分子生物学及转基因相关技术领域中，拟南芥被作为模式植物广泛加以研究和应用。

硝酸盐转运体(Nitrate transporters，NRTs)是一类专司硝态氮吸收、运输的转运蛋白。研究发现拟南芥基因组中存在3个NRT基因家族：NRT1、NRT2和NRT3，其中NRT3基因家族包含2个成员(NRT3.1和NRT3.2)。前人的研究证明NRT3.1基因为硝酸盐高亲和性吸收转运体，在低氮素条件下，该基因的敲除突变体生长明显弱于野生型(Mamoru Okamoto.et al，Plant Physiology，March2006，Vol.140，pp.1036-1046)。但至今还未见低氮条件下该基因调控地上部生物量的报道。

发明内容：

本发明提供一个拟南芥硝酸根离子高亲和性转运体基因，以及该基因对低氮胁迫的反应和生理机制。

所提供的硝酸盐高亲和性转运体基因为NRT3.1(AT5G50200)。

上述基因具有SEQ ID No.1的碱基序列。

上述基因编码的蛋白质具有SEQ ID No.2的氨基酸序列。

NRT3.1基因的T-DNA插入突变体CS876661是从ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center)定购获得。通过PCR鉴定获得纯合插入突变体，通过RT-PCR在mRNA水平上鉴定基因的敲除情况。

通过上述鉴定，获得NRT3.1基因T-DNA插入突变体CS876661的纯合株系，并以之为材料进行低氮处理，观察低氮表型并拍照。然后对低氮处理后的拟南芥幼苗进行耐低氮相关指标的测定，包括：地上部干重测量，根部和地上部含氮量统计等。

附图说明：

图1显示野生型和突变体PCR和RT-PCR检测的电泳结果，结果表明获得了NRT3.1基因T-DNA插入突变体株系CS876661的纯合插入株系，其转录本被敲除。

图2显示野生型和突变体低氮处理7天的表型照片，结果表明在0.1mMNO₃^-的培养条件下，突变体比野生型更早白化死亡，表现低氮敏感表型。

图3显示野生型和突变体低氮处理7天的地上部干重统计，结果表明在0.1mM NO₃^-的培养条件下，突变体地上部干重极显著小于野生型(P＝0.002)。

图4显示0.1mM NO₃^-处理后野生型和突变体根部和地上部含氮量差异，结果表明突变体根部和地上部含氮量均极显著低于野生型(P＝0.001，P＝0.009)。

具体实施方式：

下面结合实验方法和数据进一步阐述本发明。

1.拟南芥幼苗培养：

野生型和突变体种子分别用0.5％次氯酸钠溶液浸泡消毒10min，消毒后的种子放入4℃冰箱春化2天后点布于含1％琼脂的MS(Murashige and Skoog)固体培养基上，置于22℃光照培养箱中萌发生长。

2.纯合突变体的鉴定：