[发明专利]一种以异型双功能试剂为连接桥的脑膜炎多糖结合疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明提供了一种新型的制备脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖结合疫苗的结合技术；基于此结合技术，制备出了脑膜炎荚膜多糖结合疫苗，可用于脑脊髓膜炎等重要疾病的免疫预防，属于生物医药领域。

背景技术

流行性脑膜炎是由脑膜炎奈瑟氏球菌引起的脑膜发炎的疫症，至今仍未得到有效控制。脑膜炎奈瑟氏球菌主要经由咳嗽，喷嚏或接吻传播，由鼻咽部侵入血循环，最后局限于脑膜和脊髓膜，形成化脓性脑脊髓膜病变。常见的病征包括发高烧、剧烈头痛、后颈僵硬；亦会有嗜睡、呕吐、惧光或皮疹等情况出现。此病可引致脑部受损甚至死亡，病死率较高，维持在5-10%之间，遍见于世界各国，呈散发或大、小流行，以儿童发病率为高。

使用抗生素可以有效治疗流行性脑膜炎。在未使用抗生素以前该病的病死率在70%左右，使用抗生素治疗以来病死率降低至5%～15%，甚至低于5%。然而，由于抗生素的过度使用，细菌的耐药菌株数量和种类迅速地增长，导致治疗更加困难。这引起了医学界的广泛忧虑，并增加了病人的治疗成本和难度。为了应对不断恶劣化的抗药性病菌对人类的威胁，世界各地的医生开始严格地控制使用抗生素，同时扩大疫苗的接种范围。因此，研制与开发预防流行性脑膜炎的疫苗具有十分重大的意义。

脑膜炎奈瑟氏菌根据其荚膜多糖的特异性可将脑膜炎球菌分成A、B、C、D、29E、H、I、K、L、W_135、X、Y、Z十三个血清群，所有血清群的细菌均可致病，但A、C、W₁₃₅和Y毒力最强，上述4个血清群占病例数的95%以上，是引起脑膜炎流行最常见的菌株。荚膜多糖能够屏蔽细菌细胞表面功能成分，使其免于被宿主免疫系统识别，防止补体系统被细菌表面的蛋白激活和免疫细胞吞噬。如果细菌被免疫细胞吞噬，荚膜多糖也能够避免细菌被杀灭。荚膜多糖是脑膜奈瑟氏菌的主要抗原成分之一，作为疫苗对较大的儿童有一定的保护力。然而，荚膜多糖对2岁以下婴幼儿、老年人以及B细胞免疫缺陷的人群免疫效果差，接种剂不能达到抗体保护水平，且抗体很快消失。该多糖疫苗与其它多糖疫苗一样，属T细胞非依赖性抗原，具有年龄相关的免疫原性，且不诱生T细胞依赖性的加强应答。通过将多糖与某种蛋白质共价结合，可使多糖转化成T细胞依赖性抗原，从而刺激婴幼儿的T细胞依赖性抗体的合成，并可产生加强应答，同时还能提高免疫球蛋白(IgG)的抗体比例。这种多糖结合疫苗不仅能够保护婴幼儿(2岁以下儿童)，还能够大大地增强抵抗力差的病人对细菌感染的抵抗力，因此具有十分广阔的应用前景。

细菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗最早出现在20世纪30年代，Goebel和Avery将3型肺炎球菌多糖连接到马血清球蛋白上，产生的偶联物能在动物身上产生多糖专一的抗体，同时提供相应的免疫保护。1987年，世界上第一个多糖蛋白结合疫苗，B型流感嗜血杆菌(HiB)多糖-破伤风类毒素(TT)结合疫苗被美国FDA批准进入市场。默克公司、辉瑞公司和诺华公司相继开发了HiB多糖-破伤风类毒素结合疫苗和流行性脑膜炎多糖-破伤风类毒素结合疫苗，并成功上市。

中国专利（ZL02159032.X）公开了一种多糖-蛋白结合疫苗的制备方法，也是目前制备多糖结合疫苗最常使用的技术之一。在该技术中，以己二酸二酰肼(ADH)作为连接剂结合多糖与蛋白。这种结合方式首先需要将多糖经溴化氰活化，即在碱性条件下用溴化氰作用于多糖分子上的羟基，形成氰酸酯，然后与ADH反应；氰酸酯中的一个碳氧键断裂，与ADH一端的氨基发生加成反应，从而将酯酰肼(AH)基团导入多糖分子，形成多糖-AH衍生物；多糖-AH衍生物在碳二亚胺(EDAC)的介导下与载体蛋白形成稳定的结合物。这样的结合方式可减少多糖与载体蛋白结合的空间位阻，保留了多糖的抗原表位，同时避免了多糖本身的溶解性，减少多糖与抗血清反应的副作用。

然而，上述传统的多糖-蛋白结合技术存在着以下不足之处：（1）多糖-AH衍生物会继续与溴化氰活化的多糖反应，形成多糖的自身聚合物，降低了多糖-蛋白的结合效率；（2）EDAC在介导ADH衍化多糖与载体蛋白结合的同时，容易引起多糖与载体蛋白的自身交联，从而降低多糖-蛋白的结合效率；（3）多糖和载体蛋白均为大型生物分子，中间靠仅有6个碳原子长度的ADH相连，多糖和蛋白质的结构势必会相互影响，使得多糖的一些重要抗原表位易被蛋白质所屏蔽，进而降低多糖的免疫原性。因此，多糖-蛋白结合疫苗的免疫原性和抗体持效性仍有待进一步提高，如多糖结合疫苗需要免疫三次才能产生免疫效果。这些不足之处限制了多糖结合疫苗的进一步发展。