[发明专利]一种检测含有KPC-15基因肺炎克雷伯菌的PCR试剂盒

权利要求书

1.一种KPC-15的PCR检测试剂盒，包括DNA裂解液、PCR反应液、阳性对照样品、高保真PCR酶；

其中所述的DNA裂解液包括：100mM的NacCl，pH8.0的10mM的Tris-HCl，pH8.0的25mmol/L的EDTA，按重量体积比含量为1％的SDS和4μg/μL的蛋白酶K的混合溶液。

所述的PCR反应液包括：终浓度各50-400μmol/L的4种dNTPs，终浓度为0.1-0.5μmol/L的引物KPC-15TF和KPC-15TR，其核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；1.5-5.0μmol/L的Mg²⁺。

所述的阳性对照样品为KPC-15基因的阳性质粒。

2.权利要求1所述试剂盒检测KPC-15的方法，具体包括以下步骤：

1)样品的预处理：取检测的样品，加入600μL灭菌的生理盐水充分洗涤样品得到含目标菌的悬液。

2)PCR扩增：按照扩增数n(n＝样品数+2)取PCR反应液，高保真PCR酶混匀于一离心管中，按每管分装，盖上管盖备用。先将阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的DNA加入对应的反应管中，最后取出阳性对照加入另一反应管中，各反应管标记后离心，取出置PCR仪上。PCR扩增程序：95℃预变性5min后，95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，如此进行30个循环；最后72℃延伸10min，同时应设立阳性和阴性对照。

3)PCR扩增产物分析：取5-10μL扩增后的样品，采用1.2-1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测目的基因，当PCR扩增片段大小为284bp时，样品判定为阳性，即样品含有KPC-15基因；当PCR扩增产物为出现284bp的片段时，样品判定为阴性，即样品不含有KPC-15基因。