[发明专利]重组鲤鱼PKCδ基因、蛋白及其制备与检测方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组鲤鱼PKCδ基因、蛋白及其制备与检测方法和应用。

背景技术

蛋白激酶C (Protein kinase C, PKC)与许多细胞生物效应有关, 在细胞信息传递中具有重要作用。由于P K C 是促癌剂佛波酯在细胞内的高亲和力受体, 因而在肿瘤发生发展中的作用引起人们重视, 已发现多种肿瘤组织中PKC含量高于正常。

到目前为止，在哺乳动物组织内已确定10种PKC亚类（8-3），分为A、B、C三组，A组称为典型或传统的PKC（classicalor conventional PKC,CPKC），包括α、βI、βⅡ和 γ亚类，其中βI和βⅡ有高度的同源性，是由同一mRNA的不同剪接而成，A组成员分子量在76-78kDa。B组为新型PKC（atypical PKC,aPKC），包括δ、ε、η（L）和θ亚类，分子量在77-83kDa。C组为非典型PKC（atypicalPKC,aPKC），由ζ和λ亚类组成，分子量较小为67kDa。其中，PKCδ在调控人和鼠肝细胞生长和抗氧化中起着重要作用。

迄今，关于PKCδ在哺乳动物细胞生长、增殖和抗氧化中发挥调节作用的研究已在人、大鼠、小鼠等哺乳动物的细胞中开展，并取得了许多成果，但未见有鲤鱼PKCδ基因的cDNA核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种重组鲤鱼PKCδ基因、蛋白及其制备与检测方法和应用。

本发明解决上述问题所采用的技术方案是：一种重组鲤鱼PKCδ基因，为下述序列之一：1)序列表中SEQ ID No：1所示的基因序列；2) 将SEQ ID NO :1所示的基因序列经过一个或几个碱基的取代、缺失或添加且与SEQ ID No：1所示的基因序列表达的氨基酸序列相同的基因序列。

一种重组鲤鱼PKCδ氨基酸序列，为下述序列之一：1) SEQ ID NO :2所示的由权利要求1所述重组鲤鱼PKCΔ基因所表达的氨基酸序列；2)将SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与具有与SEQ ID NO :2的氨基酸序列相同活性的由SEQ ID NO :2序列衍生的蛋白质。

一种上述重组鲤鱼PKCδ基因的制备方法，包括下述步骤：

1）采集鲤鱼的总RNA并以其肠道组织总RNA为模板进行反转录操作，得到cDNA第一链；

2）以步骤1）中的cDNA第一链为模板，利用引物P1、P2进行PCR扩增，得到SEQ ID NO :1所示的序列，所述引物P1具有SEQ ID NO :3所示的序列，引物P2具有SEQ ID NO :4所示的序列；所述步骤2）中以Pl、P2为引物，利用DNA聚合酶进行PCR反应的50μl PCR扩增体系中各组分及其比例为：cDNA第一链，2.5 μl；50μM 的P1，0.25μl；50μM的P2，0.25μl；10×LA PCR Buffer II (Mg²⁺ Plus)，5.0μl；each 2.5 mM 的dNTP Mixture，8.0μl；ddH₂O，33.5μl；5 U/μl的DNA聚合酶，0.5μl；反应循环条件：94℃预变性1min；94℃变性30sec，60℃退火30 sec，72℃延伸2 min，共40个循环；最后72℃延伸 10 min，反应完成。

一种上述制备的重组鲤鱼PKCδ基因的检测方法，包括下述步骤：

1）将P1和P2 的PCR回收产物的PCR扩增采用2×Taq PCR MasterMix进行，50μl PCR扩增体系中各组分及其比例为：50倍稀释的PKCδ回收产物，1.0μl；50μM的P3，0.25μl；50μM 的P4，0.25μl；2×Taq PCR MasterMix，25.0μl；ddH₂O，23.5μl；反应循环条件：94℃预变性1min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸5 min，反应完成；所述P3具有SEQ ID NO :5所示的序列，引物P4具有SEQ ID NO :6所示的序列；

2）取5μl PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶在100V，10 min的条件下进行电泳检测，凝胶成像系统观察分析结果。

具体地，该检测方法中，所述50倍稀释的PKCδ回收产物指重组鲤鱼PKCδ基因cDNA编码区核苷酸序列的制备方法中所制备的重组鲤鱼PKCδ基因cDNA序列。