[发明专利]用于检测蛋白质互作的荧光素酶互补图像检测方法及载体试剂盒无效
申请号: | 201310046363.4 | 申请日: | 2013-02-05 |
公开(公告)号: | CN103849645A | 公开(公告)日: | 2014-06-11 |
发明(设计)人: | 陈华民;周俭民;何晨阳;田芳 | 申请(专利权)人: | 中国农业科学院植物保护研究所 |
主分类号: | C12N15/82 | 分类号: | C12N15/82;C12N15/84;C12Q1/66;C40B30/04 |
代理公司: | 北京海虹嘉诚知识产权代理有限公司 11129 | 代理人: | 张涛 |
地址: | 100193 *** | 国省代码: | 北京;11 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 用于 检测 蛋白质 荧光 互补 图像 方法 载体 试剂盒 | ||
1.用于检测蛋白质互作的荧光素酶互补图像检测的表达载体,N端载体为表达荧光素酶N端2~416位多肽片段Nluc的pNG或pUC-Nluc-G,C端载体为表达荧光素酶C端398~550位多肽片段Cluc的pCG或pUC-Cluc-G,
所述pNG及pUC-Nluc-G的构建过程如下:用限制性内切酶KpnI-SalI消化pUC-Nluc切除多克隆位点序列,采用T4DNApolymerase同时对3’-突出末端切割,对5’-突出末端进行补平;然后利用碱性磷酸酶对其末端进行去磷酸化处理,获得pUC-Nluc-KS;pUC-Nluc-KS与RFC2.1片段连接得pUC-Nluc-G;用限制性酶HindIII-SacI消化pUC-Nluc-G质粒形成pUC-Nluc-G-HS;用限制性酶HindIII-SacI消化pCAMBIA-nLUC质粒切除nLUC片段,回收载体片段pCAMBIA-35S-HS;连接pUC-Nluc-G-HS片段和载体片段pCAMBIA-35S-HS得到pNG;
所述pCG的构建过程如下:用限制性内切酶KpnI-PstI消化pUC-Cluc切除多克隆位点序列,采用T4DNApolymerase同时对3’突出末端切割,对5’突出末端进行补平;然后利用碱性磷酸酶对其末端进行去磷酸化处理,获得pUC-Cluc-KP;pUC-Cluc-KP与RFC2.1片段连接得pUC-Cluc-G;用限制性酶HindIII-SacI消化pUC-Cluc-G质粒形成pUC-Cluc-G-HS;用限制性酶HindIII-SacI消化pCAMBIA-cLUC质粒切除cLUC片段,回收载体片段pCAMBIA-35S-HS;连接pUC-Cluc-G-HS片段和载体片段pCAMBIA-35S-HS得到pCG.。
2.一种用于检测蛋白质互作的荧光素酶互补图像检测方法,其步骤如下:
(1)预备N端载体和C端载体,
(2)构建待测基因的入门表达载体,
(3)构建融合表达载体:通过LR反应将一种入门表达载体中的待测蛋白基因重组克隆到pNG载体上所述N端2~416位多肽片段的氨基端得到N端LCI融合表达载体;另一种入门表达载体中的待测蛋白基因通过LR反应重组克隆到pCG载体上所述C端398~550位多肽片段的羧基端得到C端LCI融合表达载体,
(4)转化瞬时表达系统:所述N端载体为pUC-Nluc-G,所述C端载体为pUC-Cluc-G,所述瞬时表达系统指原生质体瞬时发表系统,将步骤(2)制备得到的N端LCI融合表达载体和C端LCI融合表达载体的质粒共转化到原生质体中进行瞬时表达,
或者,所述瞬时表达系统指烟草瞬时表达系统,所述N端载体为pNG,所述C端载体为pCG;将步骤(2)制备得到的N端LCI融合表达载体和C端LCI融合表达载体分别转化农杆菌中,培养农杆菌,得到转化有不同待测蛋白基因的N端农杆菌菌株和C端农杆菌菌株,按比例混合所述N端农杆菌菌株和所述C端农杆菌菌株的菌液,将混合菌液注射到烟草叶片中进行瞬时表达,
(5)加入荧光素酶底物检测发光情况:所述原生质体中加0.2%-0.5%的1mg/mL荧光素酶底物D-Luciferin钾盐,所述烟草叶面上喷1mg/mL荧光素酶底物D-Luciferin钾盐,检测发光情况,如果有发光,即说明待测蛋白之间存在互作。
3.根据权利要求2所述的检测方法,所述指农杆菌为菌株GV3101。
4.根据权利要求2所述的检测方法,所述按比例混合指两株农杆菌菌液相同浓度下按体积比1:1混合。
5.根据权利要求2所述的检测方法,当所述所述瞬时表达系统指烟草瞬时表达系统时,瞬时表达指注射农杆菌至饱和状态烟草叶片置于24~28℃条件下培养2-5天。
6.根据权利要求2所述的检测方法,所述检测发光情况采用超敏化学发光检测系统,微孔板发光检测仪。
7.根据权利要求2所述的检测方法,所述混合菌液的OD值不高于1.2。
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