[发明专利]用于检测蛋白质互作的荧光素酶互补图像检测方法及载体试剂盒

权利要求书

1.用于检测蛋白质互作的荧光素酶互补图像检测的表达载体，N端载体为表达荧光素酶N端2~416位多肽片段Nluc的pNG或pUC-Nluc-G，C端载体为表达荧光素酶C端398~550位多肽片段Cluc的pCG或pUC-Cluc-G，

所述pNG及pUC-Nluc-G的构建过程如下：用限制性内切酶KpnI-SalI消化pUC-Nluc切除多克隆位点序列，采用T4DNApolymerase同时对3’-突出末端切割，对5’-突出末端进行补平；然后利用碱性磷酸酶对其末端进行去磷酸化处理，获得pUC-Nluc-KS；pUC-Nluc-KS与RFC2.1片段连接得pUC-Nluc-G；用限制性酶HindIII-SacI消化pUC-Nluc-G质粒形成pUC-Nluc-G-HS；用限制性酶HindIII-SacI消化pCAMBIA-nLUC质粒切除nLUC片段，回收载体片段pCAMBIA-35S-HS；连接pUC-Nluc-G-HS片段和载体片段pCAMBIA-35S-HS得到pNG；

所述pCG的构建过程如下：用限制性内切酶KpnI-PstI消化pUC-Cluc切除多克隆位点序列，采用T4DNApolymerase同时对3’突出末端切割，对5’突出末端进行补平；然后利用碱性磷酸酶对其末端进行去磷酸化处理，获得pUC-Cluc-KP；pUC-Cluc-KP与RFC2.1片段连接得pUC-Cluc-G；用限制性酶HindIII-SacI消化pUC-Cluc-G质粒形成pUC-Cluc-G-HS；用限制性酶HindIII-SacI消化pCAMBIA-cLUC质粒切除cLUC片段，回收载体片段pCAMBIA-35S-HS；连接pUC-Cluc-G-HS片段和载体片段pCAMBIA-35S-HS得到pCG.。

2.一种用于检测蛋白质互作的荧光素酶互补图像检测方法，其步骤如下：

（1）预备N端载体和C端载体，

（2）构建待测基因的入门表达载体，

（3）构建融合表达载体：通过LR反应将一种入门表达载体中的待测蛋白基因重组克隆到pNG载体上所述N端2~416位多肽片段的氨基端得到N端LCI融合表达载体；另一种入门表达载体中的待测蛋白基因通过LR反应重组克隆到pCG载体上所述C端398~550位多肽片段的羧基端得到C端LCI融合表达载体，

（4）转化瞬时表达系统：所述N端载体为pUC-Nluc-G，所述C端载体为pUC-Cluc-G，所述瞬时表达系统指原生质体瞬时发表系统，将步骤（2）制备得到的N端LCI融合表达载体和C端LCI融合表达载体的质粒共转化到原生质体中进行瞬时表达，

或者，所述瞬时表达系统指烟草瞬时表达系统，所述N端载体为pNG，所述C端载体为pCG；将步骤（2）制备得到的N端LCI融合表达载体和C端LCI融合表达载体分别转化农杆菌中，培养农杆菌，得到转化有不同待测蛋白基因的N端农杆菌菌株和C端农杆菌菌株，按比例混合所述N端农杆菌菌株和所述C端农杆菌菌株的菌液，将混合菌液注射到烟草叶片中进行瞬时表达，

（5）加入荧光素酶底物检测发光情况：所述原生质体中加0.2%-0.5%的1mg/mL荧光素酶底物D-Luciferin钾盐，所述烟草叶面上喷1mg/mL荧光素酶底物D-Luciferin钾盐，检测发光情况，如果有发光，即说明待测蛋白之间存在互作。

3.根据权利要求2所述的检测方法，所述指农杆菌为菌株GV3101。

4.根据权利要求2所述的检测方法，所述按比例混合指两株农杆菌菌液相同浓度下按体积比1:1混合。

5.根据权利要求2所述的检测方法，当所述所述瞬时表达系统指烟草瞬时表达系统时，瞬时表达指注射农杆菌至饱和状态烟草叶片置于24~28℃条件下培养2-5天。

6.根据权利要求2所述的检测方法，所述检测发光情况采用超敏化学发光检测系统，微孔板发光检测仪。

7.根据权利要求2所述的检测方法，所述混合菌液的OD值不高于1.2。