[发明专利]一种抑癌肽基因重组及其抗肿瘤应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体是基因重组具有潜在抑癌作用的一段多肽并验证其抑癌功能。

背景技术

恶性肿瘤又称癌症，已成为危害人类健康的主要疾病，据统计2008年全世界约有1270万癌症新增患者，760万死于癌症，尤其在发展中国家，癌症新增例数达56%。因此，加强治疗肿瘤的研究，探索新的治疗途径具有十分重要的意义。

在癌症进展过程中，某些基因的表达发生变化，是癌症发生发展的关键基因，成为癌症治疗的潜在靶点。我们发现肿瘤组织中的表达蛋白缺少某段多肽序列后不仅丧失了抑癌功能并且促进肿瘤生长，故推测此多肽具有抑癌效应。所以，在此发明中我们利用基因重组技术，将35个氨基酸（amino acid）多肽对应的DNA序列重组到pcDNA3.1真核表达载体。经酶切和序列分析证明重组成功后，将此真核表达重组多肽转染到肿瘤细胞，免疫印迹证明多肽的蛋白表达，实现了多肽的重组。将表达多肽序列的重组真核载体转染到肿瘤细胞和动物体内的肿瘤组织中，证明其独特的抑制肿瘤生长和抑制肿瘤发生的抗肿瘤效应。发明为肿瘤治疗开发新的靶点提供实验依据，对于应用于肿瘤的临床治疗具有十分重要的开发应用前景。

发明内容

本发明是基于肿瘤发生特点和治疗难点，通过抗肿瘤基因治疗途径发明一段重组多肽，证明其具有抗肿瘤的应用价值，并提供一段抑癌肽的特异的蛋白序列和核酸序列。

本发明利用生物工程技术，基因重组一段35个氨基酸（amino acid）多肽对应的DNA序列到pcDNA3.1真核表达载体。经酶切和序列分析证明重组成功后，将此真核表达重组多肽转染到肿瘤细胞，免疫印迹证明多肽的蛋白表达，实现了多肽的重组。接着对多肽的抗肿瘤功能进行了研究，细胞学和小鼠体内实验表明此多肽具有抑制肿瘤细胞活性和抑制小鼠成瘤模型的发生与生长的重要抗癌功能。

本发明的多肽重组表达质粒是将此多肽对应DNA序列连接进pcDNA3.1真核表达载体，多肽的氨基酸序列和对应DNA序列见SEQ ID NO.1和NO.2。

第一步，重组肽的克隆载体构建

提取人的mRNA，体外逆转录成cDNA，以此为模板，通过PCR方法扩增得到的目的片段与pGEMT-easy载体连接，经转化、提取等步骤得到重组质粒后，酶切鉴定并测序。

第二步：重组肽真核表达载体构建及其表达检测

将克隆质粒和质粒pcDNA3.1双酶切后，利用回收试剂盒获得目的片段和载体连接。经转化、提取等步骤获得重组真核表达载体。酶切鉴定重组体，并且测序进一步确定；将正确连接的多肽真核表达载体转染LNCaP细胞，48小时后搜集样品，免疫印迹结果证明了此多肽的表达。

第三步：多肽抗肿瘤功能的检测

1．细胞学实验

将重组肽真核表达质粒转染肿瘤细胞后，48小时后检测细胞活性，MTT结果显示此多肽具有显著抑制肿瘤细胞增殖的显著作用

2.小鼠体内成瘤模型

转染重组肽真核表达载体后，构建小鼠皮下肿瘤模型，15天后皮下生长肿瘤，隔日测量肿瘤大小，绘制生长曲线，25天后，处死小鼠，剥离肿瘤，称量重量，实验结果显示此多肽显著抑制肿瘤细胞生长。

 

附图说明：

图1. 35aa多肽对应DNA序列PCR结果

图2. 35aa多肽克隆质粒鉴定

图3. 35aa多肽重组真核表达载体酶切鉴定结果

图4. 检测35aa多肽的表达，大小为4KD

图5A. MTT实验检测35aa多肽抑制LNCaP细胞增殖

图5B. MTT实验检测35aa多肽抑制DU细145胞增殖

图6A. 小鼠成瘤模型肿瘤生长曲线图

图6B. 小鼠成瘤模型肿瘤生长大小图。

 

具体实施方式：

 实施例一：35aa多肽重组

1. 重组肽的克隆载体构建

提取人的mRNA ,逆转录为cDNA， 以cDNA为模板，上游引物为5’-GGATCCAGATGGTAGGCTCCCCTGGTCCTCTA（含BamHI酶切位点）；下游引物为5’-CTCGAGTCACTGGGGCAGAGGGGG（含XhoI酶切位点），应用PCR技术成功扩增出35aa对应的105bp的mRNA序列[图1]。扩增得到的片段与pGEMT-easy载体连接，将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5α中，在含Amp⁺琼脂平板上挑选克隆，以碱裂解法小提重组质粒后，以ECOR1酶切鉴定[图2]