[发明专利]一种制备长心卡帕藻原生质体的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的说是一种利用篮子鱼内脏提取液制备长心卡帕藻原生质体的方法。

背景技术

长心卡帕藻是国际上产κ-卡拉胶的重要热带红藻资源。κ-卡拉胶是海藻细胞粘性多糖，由D-半乳糖及其衍生物组成的大分子构成，具有广阔的市场开发和应用前景。卡拉胶具有凝胶和保水特性,具有一定硬度，因此是支撑奶制品、火腿、冰淇淋等食品制造行业的重要加工原料，在食品、化工等领域有非常广泛的应用前景。卡拉胶在医药上也有较好的应用前景,研究表明皮下注射卡拉胶可刺激结缔组织可逆生长,并能刺激骨胶原的生长,增加骨骼对钙的吸收。有报道研究表明麒麟菜提取物对风湿性关节炎有疗效,对胃溃疡和十二指肠溃疡也有治疗作用,在抗血凝及免疫方面也具有重要的生理活性等。近年来，卡拉胶在医药工业中应用越来越广泛，可用于植物性薄膜包衣和胶囊，可有效发挥其具有无交联反应、药物吸湿低、无动物源传染病风险、不易与含醛基药物反应、以及易于废弃材料再利用和利润高等诸多优点，κ-卡拉胶是制备药材包衣和胶囊的最好植物性原料之一。

国际上长心卡帕藻栽培多在热带和亚热带地区进行，长心卡帕藻主产区在印度尼西亚和菲律宾等东南亚国家和地区。除我国海南外，在菲律宾、印度尼西亚、马来西亚、越南等东南亚国家和斐济等太平洋岛域，以及中南美洲的墨西哥、巴西，和非洲的肯尼亚、坦桑尼亚等热带国家和地区，上述产胶海藻都已经实现了人工规模化栽培，共同支撑着国际上逐年增长的卡拉胶市场需求。目前，这些红藻原料只有很少一部分来自于珊瑚礁等热带海洋自然生境中的海菜，大多数源自于人工栽培海菜，而该藻的规模化人工栽培主要依赖于营养繁殖，其孢子繁殖和有性生殖方式已经严重退化，生产过程中难以发现。

应当指出，至今为止，长心卡帕藻一直沿用人工选育的野生种苗为苗源，然而该藻长期营养繁殖方式栽培已经造成种质退化，海菜生长速度减缓、产胶性能降低和抗病能力下降。由于藻种无性和有性繁殖高度退化，只能依赖于营养繁殖方式扩大栽培，其遗传育种和育苗工作步履艰难，在国内外尚没有实质性突破。如何开展新品种培育，恢复和提高种质优良生产性状是该领域关注的研究热点问题。

通过制备原生质体，进而结合细胞融合和愈伤组织等生物技术培育优良品种，目前已在许多生物物种中得到证实和应用，能否适用于长心卡帕藻种质种苗培育，目前尚难评论。但无论如何，制备长心卡帕藻原生质体是通过该途径培育种苗的基础和第一步工作，受该藻细胞壁中含有大量κ-卡拉胶的限制，传统酶解技术效果不明显。

发明内容

本发明目的在于提供一种制备长心卡帕藻原生质体的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种制备长心卡帕藻原生质体的方法，以经长心卡帕藻饲喂诱导的杂食性热带篮子鱼消化内脏器官为原料，提取混合消化酶液，再由所得混合酶液降解长心卡帕藻细胞壁及其细胞间质组分，从中获取游离的长心卡帕藻原生质体。

所述原料为预先用富含κ-卡拉胶的长心卡帕藻饲喂篮子鱼7天以上，而后收集篮子鱼消化内脏器官组织。

所述原料在50mM和pH值6.0±0.1的磷酸缓钠盐缓冲液中冰冻研磨、均浆，再经过滤去除杂质，即得到混合消化酶液。

所述混合消化酶液中加入渗透剂和膜稳定剂共同作为酶解液，而后与长心卡帕藻混合在25±2℃条件下，连续轻微震荡酶解10-12小时，即可获得游离的长心卡帕藻原生质体。

所述混合消化酶液中加入渗透剂、膜稳定剂、以及强化作用效果的纤维素酶和果胶酶共同作为酶解液，而后与长心卡帕藻混合在25±2℃条件下，连续轻微震荡酶解10-12小时，即可获得到游离的长心卡帕藻原生质体。

将上述酶解后酶解液中加入洗脱液在25±2℃条件下，震荡酶解1±0.2小时，酶解后过滤，滤液离心，弃去最上层的清液，再加入洗脱液悬浮并充分混匀，再次离心收集沉淀，沉淀再经洗脱液悬浮即为长心卡帕藻原生质体；其中洗脱液为含0.6M甘露醇和5mM氯化钙的F/2培养基溶液；酶解液与粉碎后的长心卡帕藻泥体积比为：3：1。

本发明所具有的优点：针对长心卡帕藻有性和无性繁殖高度退化，培育新品种困难问题，采用本发明利用摄食该藻的篮子鱼诱导和制备消化酶解粗提液的方法，可有效获得长心卡帕藻原生质体；有望结合细胞融合和愈伤组织等技术，进而形成培育藻株的新途径，实现该藻种质种苗培育。

附图说明