[发明专利]多糖粘液形成菌的靶基因缺失

说明书

本申请是申请日为2006年2月3日，申请号为“200680009973.5”，发明名称为“多糖粘液形成菌的靶基因缺失”的申请的分案申请。

本申请要求2005年2月4日提交的美国临时申请第60/649,559号的权益。

技术领域

本发明涉及鞘氨醇胶多糖制备领域。特别地，其涉及用于改进制备鞘氨醇胶的菌株的定点基因方法。

背景技术

鞘氨醇单胞菌(sphingomonas)菌株，例如ATCC53159和ATCC31461产生大量的荚膜多糖。尽管在某些条件下，多糖可以由细胞释放[5，6]，但在具有丰富碳源的生长过程中(如发酵)，多糖牢固附着于细胞表面。提高丢坦糖胶(diutan)和吉兰糖胶(gellan)发酵产率的尝试受到荚膜性质的多糖的限制，所述荚膜性质的多糖可以破坏营养素的吸收。另外，如果用于多糖的生物合成的位点数量有限，就会有由各细胞能产生多糖的最大量。已经观察到多糖吉兰糖胶与细胞凝集有关，这是由于不产生任何多糖的突变体在悬浮液中均匀地生长[3]。这些细胞凝集块可以干扰多种技术，例如通过光密度测定细胞数量，细胞的离心(例如用于分离DNA或蛋白质)，以及用于多糖纯化的细胞分离或裂解。

先前尚未确定与鞘氨醇单胞菌中多糖附着于细胞表面有关的附着机制和基因。已经分离了以粘液形式产生多糖的鞘氨醇单胞菌菌株ATCC31461、ATCC31555、ATCC31554和ATCC21423的诱导突变体，但是未确定突变基因，且未公开诱导和筛选突变体的方法[10]。已经分离了用于吉兰糖胶[3，8]、丢坦糖胶[1]和鞘氨醇胶S-88[9]生物合成的基因。许多这些基因的功能通过生物化学试验给出或者通过与数据库例如GenBank中的已知功能的基因的同源性给出。例如，已经鉴定了与四糖重复单元[7，8]的装配和前体dTDP-L-鼠李糖[3，9]的合成有关的基因。预期仅影响多糖附着于细胞表面的基因仍具有产生多糖的表型(即固体培养基和粘性发酵液上的粘液样菌落)。

除了不在基因簇中的用于吉兰糖胶合成的四种基因外，还描述了跨越21kb的18种用于吉兰糖胶生物合成的基因的基因簇。Harding N.E.，Y.N.Patel，and R.Coleman，2004。伊乐藻鞘氨醇单胞菌ATCC31461中具有吉兰糖胶多糖生物合成所需的基因的结构。J Ind Microbiol Biotech31：70-82，参考文献3。其DNA序列于2003年6月存放于GenBank中(登录号AY217008)。基因簇中的基因有gelM、gelN以及gelI。构建了大多数相邻基因gelM和gelN的缺失。通过插入灭活gelI基因。gelM-gelN缺失株和gelI突变株显示产生数量有所减少的吉兰糖胶和更具流动性的发酵液，且显示所产生的吉兰糖胶具有与野生株的吉兰糖胶相同的组成。多糖至细胞的附着未有报道。

伊乐藻鞘氨醇单胞菌的gelR、gelS及gelG基因似乎以与S-88sps基因簇中相同的顺序存在于操纵子中，但不邻近18个基因的基因簇中的基因(参考文献3)。GelR蛋白较其S-88同源物稍小(659和670个氨基酸相比)，具有49％的同源性，且与表层蛋白和其他膜蛋白具有同源性。gelR、gelS及gelG基因的DNA序列于2003年6月存放于GenBank中(登录号AY220099)。该报道中未构建gelR的突变(参考文献3)。Yamazaki等报道在基因spsR中具有突变的菌株仍为粘液样，表明它们产生多糖，但多糖不具有流变学或附着于细胞的特征([9]和T.J.Pollock等，DNA segments and methods for increasing polysaccharide production.U.S.Patent No.5,854,034)。

Yamazaki描述了四种鞘氨醇单胞菌菌株的典型突变体，其产生作为粘液而非附着于细胞的多糖。美国专利第6,605,461号。Yamazaki未描述如何筛选粘液表型的诱变培养物。Yamazaki未鉴定出哪个基因或哪些基因被诱变。