[发明专利]抗稻曲病基因关联抗病同源序列及其分子标记获取方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物抗病基因的植物基因工程以及分子标记辅助育种领域，具体涉及一种抗稻曲病基因的抗病基因同源序列及其分子标记，及其专用引物在水稻抗稻曲病中的应用。 

背景技术

水稻稻曲病是一种水稻穗期病害，在世界主要稻区都有发生，且逐年加重，严重危害水稻的产量和品质；并且该病菌含有人、畜、禽有毒害物质以及致病色素，对人造成直接和间接的伤害。由于稻曲病病菌侵染时期以水稻孕穗到开花期为主，而发病期则在灌浆期，这样病菌侵染与发病并不在同一时期，往往造成人工化学防治滞后，致使病害大发生；另一方面，化学防治成本高、费时费工，容易造成人员中毒和环境污染。因而，种植抗性品种来控制稻曲病病害，被认为经济有效，环境友好的方法。但是，由于稻曲病病害属于穗部病害，接种鉴定周期长，易受到外部环境的影响，基于表型抗性鉴定选择抗性植株非常困难，因而抗稻曲病育种进展非常缓慢。 

另外，由于稻曲病抗性属于数量性状，单一的抗稻曲病基因位点（Quantitative Trait Loci,QTL）是无法抵抗稻曲病病菌的侵染，所以抗稻曲病育种需要抗稻曲病基因位点的聚合。目前，对于水稻抗稻曲病基因位点的定位进展较慢，徐建龙等（徐建龙，薛庆中，罗利军，黎志康.近等基因导入系定位水稻抗稻曲病数量性状位点的研究初报．浙江农业学报，2002，14(1)：14一19．）利用Lemont／特青的近等基因导入系在第10、12染色体上检测到两个水稻稻曲病抗性数量性状位点。李余生等（李余生，张亚东，朱镇，赵凌，王才林.利用重组自交系分析水稻稻曲病抗性位点及效应.中国水稻科学，2008，22（5）：472-476）利用大关稻／IR28重组自交系群体和微卫星（SSR）标记检测了对稻曲病抗性的数量性状位点（QTL），共检测到5个QTLs。但是，这些抗稻曲病QTLs所用标记是微卫星（SSR）标记，并非直接标记抗性基因位点，将它们利用到育种实践中尚未见到有关报道。 

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻抗稻曲病基因位点分子标记，通过检测这些与抗稻曲病关 联的分子标记，可以预测水稻植株的稻曲病抗性，加快抗稻曲病水稻新品种的选育速度，简 

化选育手段。

本发明实施例是这样实现的，抗稻曲病关联RGA引物及其产生的抗病同源序列片段以及相对应的抗病同源序列在Rice Genome Annotatation Project上的注释号如下： 

进一步，该获取方法通过如下步骤获得RGA标记及其对应抗病同源序列： 

RGA引物设计，根据从上检索到的全基因组抗病同源序列，利用引物设计软件PrimerPremier6设计了水稻全基因组RGA引物； 

137份全球核心种质RGA基因型鉴定，用CTAB法提取137份全球核心种质的DNA，用设计的备选RGA标记137份全球核心种质进行RGA基因型分析，PCR反应在NBI Veriti 9600 扩增仪上进行，扩增产物在6%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析，并记录带型； 

137份全球核心种质抗稻曲病表型，于2009年-2011年三年间对137份全球核心种质进行了稻曲病抗性鉴定；利用稻曲病自然诱导和稻曲病病菌菌液微管注射法接种鉴定；待发病平稳后调查接种单株发病情况，并记录发病最高的单穗稻曲病病球数； 

分子-性状关联分析，利用单分子标记分析方法进行分子-性状关联分析，取P≤0.01，获得RGA9、RGA132、RGA170、RGA198、RGA255、RGA305和RGA306与稻曲病抗性相关联； 

联RGA标记相对应抗病同源序列测序及比对，利用关联RGA标记对稻曲病抗感种质进行克隆测序。 

进一步，关联RGA标记相对应抗病同源序列测序及比对，利用关联RGA标记对稻曲病抗感种质进行克隆测序的具体过程如下: 

抗病同源序列克隆PCR扩增体系50μl：1μl DNA,10×buffer5μl，10mM dNTP2μl,10μM引物各3μl，高保真Taq酶0.5，超纯水35.5μl； 

PCR反应程序：94℃5min;95℃20s,57℃45s,72℃1min,共35个循环；然后72℃延长7min；最后4℃保存； 

PCR产物在1%琼脂糖电泳分离，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段。再将用将目的片段构建到PMD19-T质粒载体，然后将构建好的载体转化到感受态大肠杆菌DH5α中，最后送样测序。