[发明专利]铁皮石斛内生细菌特异性巢氏PCR检测方法及所用引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种铁皮石斛内生细菌的特异性巢氏PCR检测方法。

背景技术

作为地球上最古老的生物，在38亿年的进化历史长河中，微生物与植物形成了超级共生体，双方通过基因与信息交流，微生物与植物的进化、生长繁殖、免疫、抗逆及次生代谢等产生了千丝万缕的联系。作为植物的“第二基因组”，微生物通过固氮、分泌激素、分解有机物及促进水分和矿质元素的吸收等多种途径促进植物的生长。内生菌还能分泌抗生素类物质，或直接产生活性成分而促进药用植物的品质形成。因此，微生物生态与药用植物的产量和品质密切相关，微生物生态被认为是药材道地性的重要成因之一。因此，微生物生态检测是衡量中药材的生长状况和品质控制的重要指标。

目前，微生物生态研究可采用传统分离培养及分子生物学方法。传统分离培养法由于只能培养1%左右的微生物，因此在微生物生态研究中往往作为一种辅助方法；基于16S rRNA基因的分子生物学是微生物生态研究的主要手段。根据“内共生假说”，植物中的叶绿体及线粒体均由细菌进化而来，叶绿体及线粒体的16S/18S rRNA与细菌16S rRNA具有较高的同源性，因此研究植物内生菌必须设计特异性引物以区分叶绿体16S rRNA和线粒体18S rRNA基因。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种铁皮石斛内生细菌的特异性巢氏PCR检测方法及所用引物，本发明解决了现有通用引物无法区分细菌的16S rRNA与植物叶绿体16S rRNA和线粒体18S rRNA这一难题。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种巢式PCR扩增引物，包括第一次PCR扩增引物和第二次PCR扩增引物，

第一次PCR扩增引物为：

fM1：5’-CCGCGTGNRBGAHGAAGGYYYT-3’，

rC5： 5’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’；

第二次PCR扩增引物为：

GC夹-f515：5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGGT GCCAGCMGCCGCGGTAA-3’；

rC5： 5’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’。

本发明还同时提供了利用上述巢式PCR扩增引物进行的铁皮石斛内生细菌的特异性巢氏PCR快速检测方法，包括如下步骤：

1）、铁皮石斛总基因组DNA的提取；

2）、特异性巢氏PCR扩增16S rRNA基因的特定片段：

第一次PCR扩增时，退火温度为50-54℃；

第二次PCR扩增时，退火温度为55-59℃；

3）、DGGE分析；

将巢氏PCR的第二次扩增产物进行DGGE电泳； 

4）、内生细菌的种属鉴定：

选择清晰的DGGE条带，进行PCR扩增；将扩增片段进行克隆、测序和BLAST比对，确定其种属特征。

作为本发明的铁皮石斛内生细菌的特异性巢氏PCR检测方法的改进：

步骤3）为：

DGGE电泳采用6%丙烯酰胺凝胶（60g丙烯酰胺溶于1000ml水而得）、30%-60%的变性剂浓度梯度；打开电泳仪使电泳缓冲液（1×TAE电泳缓冲液）预热60-120min至温度为55-65℃；加40-60μ1 PCR产物（即，步骤2）第二次PCR扩增所得），120-180V电泳5-10h后，将DGGE胶在EB溶液（浓度为0.5μg/ml的溴化乙锭溶液）中染色10-20 min，脱色15-30min，用凝胶成像系统拍照。

作为本发明的铁皮石斛内生细菌的特异性巢氏PCR检测方法的进一步改进：

步骤4）为：

选择清晰的DGGE条带，割胶回收于1.5ml Eppendorf管中，用无菌研磨棒研磨，加入50 μ1无菌水，37℃温浴15-30 min，置4℃冰箱12-16h；1500~2500 rpm离心4~6min，吸取3-5 μ1上清作为模板，用引物f515和rC5进行PCR扩增，退火温度为54-58℃；将扩增片段进行克隆、测序和BLAST比对，确定其种属特征；

引物f515：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’，

引物rC5：5’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’。

备注说明：

本发明所涉及的引物中：N=(A/G/C/T)，R=(A/G)，B=(G/C/T)，Y=(C/T)，H=(A/C/T)；M=(A/C)。