[发明专利]抗HER2蛋白单克隆抗体及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种抗HER2蛋白的单克隆抗体，产生该抗体的杂交瘤细胞株，以及该抗体的免疫检测用途。

背景技术

HER2基因又称为ERBB2基因，编码一种具有酪氨酸激酶活性的蛋白，是表皮生长因子受体家族的一个成员，能增强激酶活性，促进细胞的分裂、增殖和转化。HER2基因主要是在人体的胚胎发育时期表达，参与多种组织器官的生长发育，而在成人正常组织中此基因常以单拷贝存在，表达水平较低。

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，发病率约10%-15%，病人最后多死于远处转移。HER2基因作为肿瘤发生的癌基因，与乳腺癌的侵袭转移及预后密切相关；在乳腺癌中可见到该基因的异常扩增或过表达，有研究指出在20%～30%的侵袭性乳腺癌患者中有HER2扩增；HER2蛋白的高表达出现在乳腺癌发生的早期阶段。临床前研究发现，HER2的高表达提高了乳腺癌细胞的转移潜能，表现出较多的侵袭性临床病理特征。2003年NCCN乳腺癌诊疗指引已明确建议，对原发性浸润性乳腺癌组织病理学检查中常规进行HER2检测，有助于药物的使用和评估预后。另外，除乳腺癌外，在其他许多上皮来源的肿瘤如卵巢癌和胃癌等肿瘤细胞中，HER2基因也常常有异常扩增或过表达。

目前临床上通常通过免疫组织化学病理实验检测肿瘤细胞中HER2蛋白的表达状况，而免疫组化实验的核心为一抗，即可特异性结合HER2蛋白的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性高的抗HER2蛋白的单克隆抗体具有重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题为提供一种结合特异性较高的抗HER2蛋白的单克隆抗体，产生该抗体的杂交瘤细胞株，及该抗体在制备用于检测HER2蛋白的免疫检测工具中的应用。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称为CGMCC），保藏日期为2012年11月29日，保藏编号为CGMCC No.6908。

本发明还提供了一种特异性结合HER2蛋白的单克隆抗体，由上述杂交瘤细胞株产生。

本发明所述单克隆抗体的制备方法如下：

（1）重组表达载体的构建：根据HER2基因的ORF全序列（如SEQ ID No.1所示）设计引物进行PCR扩增，基因两侧分别引入限制性内切酶位点SgfI和MluI，并在其C末端引入Myc-DDK标签序列（标签序列如SEQ ID No.2所示），插入表达载体pCMV6-Entry，构建HER2重组表达质粒（简称为pCMV6-HER2）；

（2）HER2重组蛋白的表达与纯化：以pCMV6-HER2质粒转染HEK293T细胞，裂解离心取上清，DDK亲和层析柱纯化，获得纯化的HER2重组蛋白；

（3）单抗的筛选与制备：采用上述HER2重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗HER2特异性抗体的杂交瘤细胞株，即为本发明杂交瘤细胞株，其所分泌的抗体亚型鉴定为IgG2a；制备小鼠腹水，通过亲和层析柱纯化HER2单抗。分别通过Western Blot（结果见图3）、免疫组化实验（结果见图4、图5）验证该单抗的灵敏度和特异性。

发明人还通过OriGene高密度蛋白芯片验证了上述单克隆抗体的特异性：

OriGene高密度蛋白芯片上包含10400种HEK293T细胞蛋白过表达裂解物，每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过Excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵，每个亚矩阵上有一些参照，通过参照，可以定量每个芯片点上蛋白的含量，监控每次免疫反应数据的重复性，以及定位阳性信号的方向。

将本发明单克隆抗体与上述芯片杂交并确定阳性信号位点，结果显示：本发明单克隆抗体特异性结合HER2蛋白，与其他蛋白无交叉反应。

本发明还提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括上述单克隆抗体；可用于检测组织细胞中HER2蛋白的表达状况。

上述免疫组化检测试剂盒，还包括用于免疫组化检测的其它常规试剂；如采用免疫酶标法的免疫组化试剂盒还包括封闭试剂，针对上述单克隆抗体的生物素标记的二抗，酶标抗生物素组分和底物。

本发明的另一个目的在于提供一种上述单克隆抗体在制备用于检测HER2蛋白的免疫检测工具中的应用。