[发明专利]一种复合转氨酶校准物质的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种用于检验医学、与血清具良好互换性、稳定性的转氨酶校准物质的制备方法，属于医学检验体外诊断试剂的技术领域。

背景技术

人体内的转氨酶主要有丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT,EC2.6.1.2）以及天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST,EC2.6.1.1)，丙氨酸氨基转移酶广泛存在于肝脏、心肌、骨胳肌、肾、脑、胰、肺、白细胞和红细胞中，可逆地催化丙酮酸和谷氨酸之间的氨基转移。天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST,EC2.6.1.1)，在体内各组织中广泛存在，以心脏活性最高，其次是肝细胞。正常人血清中含量甚微，当心肌细胞或肝细胞受到损伤，天冬氨酸氨基转移酶会大量释放到人体血液中，导致血液中天冬氨酸氨基转移酶升高。

氨基转移酶测定是临床酶学测定项目中测定量最大、应用最广泛的项目，并且ALT和AST往往同时检测。在临床诊断、治疗监测、药理毒性研究、流行病学调查、健康体检及临床用血检查中，都离不开这两种酶的检测。

大中型医院实验室中，血清氨基转移酶测定普遍通过动力学法试剂盒于全自动生化分析仪完成。由于医院所用的产品来自于不同厂家的校准品，在溯源性、互通性以及稳定性方面的不明确性，另外缺含高值转氨酶性的校准物质，不同医院间结果准确性差别较大，难以得到准确、可比的信息。研制位于重要医学决定值水平附近的氨基转移酶复合校准物质，对于医学检验仪器的校准以及医学测量的质量控制具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种可溯源至国际参考物质与人血清标本，具良好互换性、高稳定性的位于重要医学决定值附近的人源性丙氨酸氨基转移酶与天冬氨酸氨基转移酶的复合转氨酶校准物质的制备方法，主要用于临床检验中常规诊断试剂中校准物质的配备以及医院的日常质量控制。

本发明的目的是通过如下技术方案完成的：

1）．高纯度酶原料的制备、纯化及测定，

以已克隆的ALT、AST基因表达载体表达至大肠杆菌的工程菌后，以ALT、AST的粗酶原料，经硫酸铵分级盐析，透析，柱层析等步骤，得到高纯度的ALT和AST纯品；

以纯化的ALT和AST为样品，用常规的生物化学方法测定血清中常见的其他酶含量，确保纯化的两种转氨酶中，基本无其他杂酶存在，对ALT与AST的活力测定无影响；

2）．基质物质的制备与分析，具体如下：

2.1基础性血清基质物质制备，

（1）以正常人血清为原料，选择健康献血志愿者样本，筛选并收集经过通过艾滋、梅毒、乙肝、丙肝指标的检测符合要求的血清样本，选择转氨酶在正常值范围内的样本，作为基质物质制备的原料；

（2）将已经筛选的血清进行：稳定性维持---去颗粒---去脂---去浊等几个步骤确定为基础性血清基质物质A；

2.2基质物质A的成分分析：用全自动生化分析仪对基础性血清基质物质A进行分析；

2.3根据分析结果对重要的组成成分浓度进行调节，其中主要为蛋白质浓度，以及离子浓度，尽量做到与正常血清一致才可，得到血清类似物B；其中目标酶浓度为正常酶浓度的2-3倍左右；

2.4渗透压调节：以渗透压调节剂调节血清类似物B的渗透压，使其成为等渗溶液，得到与血清渗透压相同的基质物质C；

2.5适量ALT,AST稳定剂：根据ALT、AST的反应性质以及影响因素，加入两种酶的不同浓度的稳定剂，确定为候选校准物质D、E；

2.6候选校准物稳定性和互通性分析：根据以上结果确定不同的基质物质，并添加为终浓度为80IU/L左右的AST、ALT混合物作为校准物质的候选物F、G；选择稳定性及互通性均符合要求的为最终的转氨酶复合校准物质。

本发明所述的步骤1）中，以基因重组的人丙氨酸氨基转移酶作为丙氨酸氨基转移酶标准物质研制的原料，基因表达载体为pReceiver-ALT。酶切及测序证明与预期结果一致后进行体外表达；将表达载体转至BL21菌种中，于含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，适时加入IPTG诱导表达，至终浓度至0.25mmol/L，于16℃进行表达，收集菌体；超声破碎后取上清；将超声破碎后的上清经过30%及50%硫酸铵沉淀进行分级分离；再将50%硫酸铵沉淀进行透析；将透析后的粗酶用镍离子金属鳌合亲和层析柱(Ni-NTA)进行纯化，得到电泳纯的ALT；