[发明专利]一种用于高通量分型检测人乳头瘤病毒的基因芯片、试剂及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明技术领域涉及一种基因芯片技术；尤其是涉及一种检测人乳头瘤病毒（HPV）DNA的基因芯片及其试剂,还涉及一种利用本方法检测样本中HPV DNA各种型别的试剂盒。

背景技术

人乳头瘤病毒（HPV）是一类感染人类上皮细胞DNA病毒，根据HPV基因组E6、E7和L1区开放阅读框核苷酸序列同源性不超过90%的定义，已发现100多种HPV型，一些型别根据上述区域同源性在90%-98%且不超过98%的定义，还可进一步分为不同的亚型。

HPV可以引起人全身各部位的皮肤或者粘膜感染，导致多种上皮组织疾病，例如皮肤寻常疣，扁平疣，外生殖器的尖锐湿疣等。宫颈上皮组织长期感染的某些型别的HPV可能引起基因突变，导致感染部位发生癌变。没有HPV感染不可能导致宫颈癌，而有HPV感染不一定会导致疾病和宫颈癌。因为HPV感染大多数是一过性感染，即在感染后短期内靠自身免疫力转归，不会导致疾病，只有少数转为持续性感染，而且也可能存在反复性的感染，据统计，80%的女性一生有可能至少感染HPV一次。能够感染人类的泌尿生殖道的40多种HPV型别中，按照导致宫颈癌风险的高低将HPV分为高危型和低危型，高危型HPV可能导致妇女发生宫颈癌，主要包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、67、69、73、82等型别，低危性HPV主要引起尖锐湿疣，包括HPV6、11、40、42、43、44、54、55、57、61、71、81、83等型别。

由于HPV目前还不能进行体外培养，免疫学的抗体检测方法缺乏可靠一致的结果，HPV的检测主要依赖于细胞学和分子生物学的基因检测方法。细胞学检测方法在检查时发现感染HPV只能是引起细胞病变之后，而HPV的DNA检测，可以在细胞学异常出现之前发现HPV的存在，从而进行预防，减少发生疾病的风险。目前分子生物学检测HPV DNA的方法主要有：（1）以抗体捕获、核酸杂交和化学发光信号放大技术为基础的第二代杂交捕获（HCII）法；（2）以PCR技术为基础的检测方法。由于PCR技术的高灵敏性，后者的检测灵敏度高于前者。由于HPV各型之间的基因存在较大的变异，多数研究者采用位于HPV基因组相对保守的L1片断的简并引物扩增后，PCR产物经过电泳、杂交等检测方法确定HPV的存在。目前常用的简并引物包括GP5/GP6,MY11/MY09,SPF，PGMY11/PGMY09等等。上述引物在扩增HPV时，具有不同的HPV型扩增谱和不同的灵敏度。目前基于PCR对多种型别HPV的检测方法常用的反向点杂交法，在一张较大的膜条（几个厘米至十多厘米）或其他基质上附着HPV检测的DNA探针，存在膜条载体面积大、杂交体积大、杂交时间长、需要使用旋转杂交仪、操作复杂等缺点，这种方法不属于基因芯片的范畴，无法做到对更多型别的多指标大样本量进行平行的高通量的快检测。

生物芯片（biochip或bioarray）是采用能够并行处理生物样本中的多个信息的微处理单元形成的集合体，根据生物分子间特异相互作用的原理，将生物分子分析过程集成于芯片表面，从而实现对DNA、RNA、多肽、蛋白质以及其他生物成分的高通量快速检测。狭义的生物芯片概念是指通过不同方法将生物分子（寡核苷酸、cDNA、genomic DNA、多肽、抗体、抗原等）固着于硅片、玻璃片（珠）、塑料片（珠）、凝胶、尼龙膜等固相递质上形成的生物分子点阵。基因芯片和DNA微阵列技术是生物芯片的一个种类，采用以阵列方式设定在平面基质载体上形成能够并行处理生物样本中多个基因信息的微处理单元，它具有微型化和并行处理的特征，点阵排布点直径在500μm以内，相邻两个点的中心点间距在1000μm以内，点阵列用于检测基因分子。利用基因芯片技术可以实现多指标大样本进行各种基因的高通量分析。

发明内容

本发明的目的在于结合核酸扩增、DNA分子杂交、信号放大技术和基因芯片技术形成一种高通量检测多种HPV型别的新方法和试剂盒。在HPV基因L1区设计简并引物进行PCR扩增样本中的HPV DNA片段；设计特异性核酸探针，通过基因芯片点样仪，将各种探针点样在平面载体上很小面积上形成基因芯片微阵列；将扩增的PCR产物与探针在特指的微孔板装置承载的孔内（利用微孔板的48或96孔作为反应池）进行分子杂交，通过信号放大，经基因芯片阅读分析仪检测芯片给出的信号，可以检测多种HPV型（包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、67、69、73、82、6、11、40、42、43、44、54、55、57），达到快速灵敏和高通量的检测效果。