[发明专利]登革2型病毒纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒及核苷酸序列

权利要求书

1.一种登革2型病毒纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：试剂盒含有Fe₃O₄纳米磁性微粒，用于分离提取登革2型病毒RNA，所述的Fe₃O₄纳米磁性微粒为表面硅羟基改性的Fe₃O₄纳米粒子。

2.根据权利要求1所述的登革2型病毒纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述Fe₃O₄纳米磁微粒分离提取登革2型病毒RNA的步骤如下：

⑴取10μl纳米磁微粒MNP（25μg/μl）溶液，用磁铁吸附MNP，弃上清；加入裂解液250μl，将MNP吹打混匀，加入登革热疑似病人血浆或血清标本50μl，混匀，60℃5min，室温静置2min；

⑵加入300μl结合液，涡旋或颠倒混匀，室温静置10min，用磁铁吸附MNP，弃上清；

⑶加入洗液清洗MNP，用磁铁吸附MNP，弃上清；重复清洗一次；3000rpm，短暂离心，用吸头吸走残液；

⑷加入洗脱液50μl，将MNP吹打混匀，65℃5min，取出后立即用磁铁吸附MNP，吸取上清液备用。

3.根据权利要求1所述的登革2型病毒纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述Fe₃O₄纳米磁微粒的制备方法为：利用热分解法分解乙酰丙酮铁，合成Fe₃O₄纳米粒子，在碱性条件下水解四乙氧基硅烷，包裹Fe₃O₄纳米粒子，形成表面为硅羟基的纳米磁性微粒。

4.根据权利要求1所述的登革2型病毒纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括如下组分：纳米磁微粒、裂解液、结合液、洗液、洗脱液、逆转录反应液、实时荧光PCR反应液、阳性对照、阴性对照；

所述结合液为无水乙醇；

所述洗液为70%乙醇；

所述洗脱液为TE pH8.0；

所述逆转录反应液包括下游引物R1，见序列2；

所述实时荧光PCR反应液包括上游引物F1，见序列1，下游引物R1，见序列2和荧光探针P1，见序列3；

所述的阳性对照为登革2型病毒质粒标准品；

所述的阴性对照为灭活的正常人阴性血清。

5.根据权利要求4所述的登革2型病毒纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述荧光探针的5′端标记报告荧光基团FAM，3′端标记淬灭荧光基团TAMRA,或其他配对的荧光标记均可。

6.一组登革2型病毒实时荧光定量PCR检测的核苷酸序列，其特征在于：其核苷酸序列为序列1、序列2、序列3，其中序列1为上游引物、序列2为下游引物、序列3为荧光探针。

7.根据权利要求6所述的登革2型病毒实时荧光定量PCR检测的核苷酸序列，其特征在于：所述荧光探针的5′端标记报告荧光基团FAM，3′端标记淬灭荧光基团TAMRA，或其他配对的荧光标记均可。

8.一种登革2型病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：含有一组如权利要求6所述的核苷酸序列。

9.根据权利要求8所述的登革2型病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：由以下组成：裂解液、逆转录反应液、实时荧光PCR反应液、质粒标准品、阳性对照、阴性对照。

所述的阳性对照为质粒浓度为1×10⁶copies/μl的质粒标准品；

所述的阴性对照为灭活的正常人阴性血清；

所述逆转录反应液包括下游引物R1，见序列2；

所述实时荧光PCR反应液包括上游引物F1见序列1，下游引物R1见序列2和荧光探针P1，见序列3；

所述的阳性对照为质粒浓度为登革2型病毒质粒标准品；

所述的阴性对照为灭活的正常人阴性血清。

10.根据权利要求8所述的登革2型病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：上游引物、下游引物、荧光探针的浓度为：上游引物200nM，下游引物200nM，荧光探针120nM。