[发明专利]表达重组人FVIII的整合质粒、细胞株及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于表达重组人凝血因子的载体、细胞株及其构建方法，特别是一种利用AAV定点整合构建表达重组人凝血因子VIII的293细胞株、其构建方法及应用。

背景技术

血友病A ( hemophilia A) 又名甲型血友病，是一种X-连锁隐性遗传病， 在男性中的发病率约为(1~2) / 10000¹。为患者定期输注血浆源性FVIII浓缩物或重组人凝血因子FVIII（rh FVIII）等FVIII制品是目前治疗血友病的主要途径。rh FVIII产品至今已应用20余年，但所有蛋白都是由中国仓鼠卵巢细胞（CHO）或幼仓鼠肾细胞（BHK）生产。天然FVIII蛋白的表达经历非常复杂的翻译后修饰（post-translational modifications,  PTMs）过程，而在非人细胞的表达系统中可能存在由于不正确的PTMs引起免疫反应或FVIII抑制剂的形成，进而导致替代疗法失效。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的一个目的在于提供一种表达重组人凝血因子的整合质粒及其构建方法

本发明的另一目的在于提供一种表达重组人凝血因子的细胞株及其构建方法，

本发明的又一目的在于提供一种基于前述整合质粒和细胞株生产重组凝血因子VIII的方法。

为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：

一种表达重组人凝血因子的整合质粒，包括：

rAAV质粒骨架，以及，

整合于所述rAAV质粒骨架中的B区缺失的FVIII基因。

进一步的，所述B区缺失的FVIII基因连接于所述rAAV质粒骨架内的两个ITR元件之间。

优选的，所述整合质粒中还可包含用作后续细胞株的筛选标记的GFP基因和/或用以提高整合效率的AAV p5 启动子。

作为较为优选的实施方案之一，所述rAAV质粒骨架包括rAAV质粒pTRP5GDNFGFP经NheI和NsiI双酶切去除GDNF基因后所形成的rAAV质粒骨架。

一种表达重组人凝血因子的整合质粒的构建方法，包括：

提供rAAV质粒骨架，并将B区缺失的FVIII基因连接至rAAV质粒骨架中，获得目标产物。

进一步的，该方法包括：将B区缺失的FVIII基因连接于所述rAAV质粒骨架内的两个ITR元件之间；

所述rAAV质粒骨架包括rAAV质粒pTRP5GDNFGFP经NheI和NsiI双酶切去除GDNF基因后所形成的rAAV质粒骨架。

一种表达重组人凝血因子的细胞株，包括经过上述整合质粒或上述方法构建的整合质粒以及用于表达AAV Rep蛋白的质粒共转染的，且能稳定表达BDD-FVIII的HEK 293细胞。

作为较为优选的实施方案之一，所述用于表达AAV Rep蛋白的质粒包括pSVAV2质粒。

一种重组人凝血因子的生产方法，包括：

培养如上所述的细胞株，而后收集培养产物，获得目标产物。

作为较为优选的实施方案之一，该方法具体包括：

将如上所述的细胞株置于适合培养HEK 293细胞的环境中，使所述细胞株长至80～90%，而后将所述细胞株无血清培养24h以上，收集培养上清，获得目标产物。

与现有技术相比，本发明至少具有如下优点：

（1）避免了重组病毒构建及纯化过程，更简单易于操作，整合率高，且无重组病毒基因组的分子量限制，具有更广泛的应用性；

（2）以人细胞作为宿主，表达的FVIII蛋白的结构与功能更接近于天然FVIII蛋白。

附图说明

图1a是本发明一较佳实施例中rAAV整合质粒pTRP5BDDGFP的图谱，该质粒是在张春构建的rAAV质粒pTRP5GDNFGFP基础上改造而成，以pZp9FVIII△BS质粒为模板（戚正武院士惠赠，参阅The Gene Expression of Coagulation Factor VIII in Mammalian Cell Lines. Thrombosis Research., 1999, 95: 105–115.）PCR扩增BDD基因全长4316bp，受CMV增强子和鸡β-actin启动子的调控，GFP作为细胞株筛选标记，两个基因表达盒皆位于AAV ITR之间；

图1b系本发明一较佳实施例中所用质粒pTRUF11的图谱；

图1c系本发明一较佳实施例中所用质粒pTRP5GDNF的图谱；