[发明专利]一种副猪嗜血杆菌-猪霍乱沙门氏菌二联基因工程苗

说明书

技术领域

本发明属于动物细菌性疾病基因工程疫苗领域，具体涉及一种无抗性标记能够表达副猪嗜血杆菌抗原基因PalA的新型副猪嗜血杆菌-猪霍乱沙门氏菌二联基因工程苗的菌株构建、疫苗制备以及疫苗应用。 

背景技术

20世纪下半叶，人类历史上爆发了两场史无前例的革命，即大规模应用抗菌药物和疫苗接种，从而使细菌感染第一次能被有效制止，一些致命性疾病如天花、狂犬病及破伤风等都可以加以防制。抗生素和疫苗如此有效使人产生一种错觉，好像人们可以很快远离病原菌，事实远非如此。经过数百万年的演变微生物学会了迅速适应环境的急剧变化，相对简单的遗传物质和极大的个体基数允许他们通过自发突变和获取外来遗传物质以更有效地应对环境变化。这种机制容易造就耐药菌株的出现，同抗生素一样，疫苗也面临着类似于细菌为适应环境发生变异的困境(Grandi，2004)。 

2006年6月以来，“无名高热综合征”在我国南方和中部几个省市大面积流行，给生猪养殖业造成了巨大的经济损失。有研究表明副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)是该病重要的继发感染或混合感染的病原之一，加重高热病的临床症状，增加死亡率。HPS原本是常规饲养猪群上呼吸道中的一种常在菌，特定条件下可侵入机体并引起严重的全身性疾病，临床表现以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎症状为主(1910)。目前市场上副猪嗜血杆菌病防控主要依赖的还是灭活疫苗和抗菌药物，只是传统疫苗的开发利用已经越来越难通过卫生管理部门提出的安全质控要求，抗生素引发的耐药问题也越来越影响到人类自身健康和公共卫生安全。新型副猪嗜血杆菌疫苗研发迫在眉睫。 

当前新型疫苗的寻找策略是基于基因组和后基因组技术，病原体的基因组学、转录组学和蛋白质组学研究，为从组成某一病原体的浩瀚分子海洋中寻找几个能引发保护性免疫反应的蛋白抗原提供了机遇。华中农业大学针对副猪嗜血杆菌全菌蛋白进行蛋白质组学分析之后鉴定出了多个免疫原性外膜蛋白，其中外膜蛋白PalA已被证明具有发展成为疫苗候选体的良好潜力。后经高通量克隆、表达与纯化，并进行适当的与保护相关的测定，证实了PalA蛋白的良好免疫原性以及其作为亚单位疫苗应用的良好前景(周明光，2009)。 

随着分子生物学技术的飞速发展，人们开始关注使用减毒沙门氏菌作为载体表达各种外源抗原，如今应用基因工程方法构建沙门氏菌减毒株和利用减毒沙门氏菌作为活载体表达外源抗原研制二联或多联疫 苗已成为研究热点。至目前为止人们已经研制出多种不含抗生素抗性标记的沙门氏菌疫苗系统，其中应用最广的是asd质粒-载体平衡致死系统。沙门氏菌asd基因编码天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶，后者是二氨基庚二酸(diaminopimelic acid，DAP)生物合成途径中的必需酶，而DAP是革兰氏阴性菌细胞壁主要化学成分肽聚糖四肽侧链的一个重要组分，沙门氏菌asd缺失株在无外源DAP条件下不能形成完好的细胞壁，从而导致溶菌死亡。将目的基因插入含asd基因的表达质粒，转化asd^-宿主菌后可形成互补，只有转化成功的含有asd质粒的重组沙门氏菌才能存活，并可在体内或体外稳定表达外源抗原。该技术以asd质粒载体平衡致死系统替代抗生素抗性标记，应用起来也更加安全。 

猪霍乱沙门氏菌(Salmonella Choleraesuis)是导致2-4月龄仔猪副伤寒的主要病原，过去曾是危害我国养猪业的主要疾病之一，现在在我国特别是农村散养户普遍存在，造成一定经济损失。动物宰杀前感染沙门氏菌或其产品受到污染，可使人发生食物中毒，因此该病原在公共卫生上也具有重要意义。目前临床上广泛使用的仔猪副伤寒商品苗是由中国兽药监察所房晓文于上世纪60年代研制，该疫苗菌株猪霍乱沙门氏菌C500具有较好的免疫原性，但仍具有一定的残余毒力，遗传背景不清晰，且存在毒力返强的风险。以现今严格规范的安全审批标准，该疫苗想要获批非常困难。 

鉴于此，我们构建了猪霍乱沙门氏菌C500的asd基因缺失突变株，并利用asd质粒-载体平衡致死系统稳定表达副猪嗜血杆菌免疫原性蛋白PalA，从而获得一株副猪嗜血杆菌-猪霍乱沙门氏菌二联基因工程疫苗菌株。鉴于猪霍乱沙门氏菌asd质粒载体平衡致死系统具有外源基因表达稳定、无需纯化及无抗性标记等优点，同时基于副猪嗜血杆菌外膜蛋白PalA的良好免疫原性，本发明开发的一种新型的副猪嗜血杆菌-猪霍乱沙门氏菌二联疫苗菌株具有良好的应用前景。 

发明内容