[发明专利]一种大菱鲆四倍体鱼苗的批量诱导方法

说明书

技术领域

本发明涉及染色体操作技术，具体地说是一种利用静水压力抑制受精卵卵裂的原理，批量诱导大菱鲆四倍体鱼苗的方法。

背景技术

大菱鲆（Scophthalmus maximus）属于菱鲆科（Scophthalmidae）、菱鲆属（Scophthalmus），其生长快，目前已经成为我国北方主要的海水养殖品种，养殖工艺和产业链也相对完善。但是，近年来大菱鲆养殖业由于累代养殖和近亲交配，造成种质严重退化。因此采取有效方法，对大菱鲆进行遗传改良，从根本上解决大菱鲆养殖产业良种化问题已成当务之急。多倍体因其周期短、见效快和安全性高等特点，一直受到研究者和养殖业者的关注。其中，三倍体鱼具有三套染色体，往往是不育的。不育三倍体生物将用于繁殖的能量转化到生长方面，表现出生长快、个体大、抗逆性强的特点，具有较高的经济价值。所以，三倍体的人工诱导和培育将会是大菱鲆良种培育不可缺少的有效途径。但鱼类三倍体人工诱导一般采用温度休克或者静水压等方法抑制受精卵第二极体排放的方式获得，且每代均需人工受精并进行诱导，操作步骤相对繁琐；人工受精和诱导也对受精卵有刺激作用，造成受精率和孵化率偏低，从而影响了其生产推广。而如果诱导获得了四倍体大菱鲆，则可通过四倍体与二倍体杂交的方式，一劳永逸进行三倍体育种。因此，开展大菱鲆四倍体诱导和培育研究，对于大菱鲆良种培育及其养殖业健康可持续发展是非常必要的；同时，也可以为其他鱼类四倍体人工诱导方法的优化提供有益参考。

人工诱导海水鱼类四倍体常采用静水压或温度休克抑制卵裂获得，由于温度休克特别是冷休克处理时间较长，对受精卵刺激较大，休克温度也不易保持稳定，诱导四倍体的效率以及成活率往往较低。而静水压法处理时间较短，对受精卵的刺激相对较小，更容易生产应用。静水压法诱导的成功率主要受处理时刻（处理起始的时间）、处理压力和处理时间（处理延续的时间）三个因素的影响，其中处理时刻是起决定作用的因素。因此，准确的确定处理时刻是鱼类四倍体诱导成功与否，以及能否获得较高诱导率的关键。目前，人工诱导四倍体在鱼类尤其是纯海水鱼类中应用还几乎没有。鲆鲽鱼类中仅在半滑舌鳎、牙鲆等中有过一些尝试性的研究，而在大菱鲆中尚未见报道。由于不同鱼种最适的处理条件往往会有很大的差别，因此，对大菱鲆四倍体诱导条件进行优化和明确是十分重要的。

发明内容

针对以往四倍体诱导实验中处理时刻无法准确确定而影响诱导效率的情况，本发明目的在于提供一种大菱鲆四倍体鱼苗的批量诱导方法。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种大菱鲆四倍体鱼苗的批量诱导方法，

1）大菱鲆人工受精：

选择性成熟的大菱鲆亲鱼，分别收集精液和卵，待用；

取上述少量精液，用少许新鲜海水激活后，迅速与卵子按体积比1:100-200混合均匀，随后补入卵子体积1-5倍量的新鲜海水进行授精，授精后将受精卵用新鲜海水冲洗干净，置于卵子体积5-10倍量的新鲜海水中培育，培育期间再补入卵子体积10-15倍量的新鲜海水，作为对照组；

待对照组人工受精15～-25min后，将上述采集的剩余精液，用少许新鲜海水激活后，迅速与卵子按体积比1:100-200混合均匀，随后补入卵子体积1-5倍量的新鲜海水进行授精，授精后将受精卵用新鲜海水冲洗干净，置于卵子体积5-10倍量的新鲜海水中培育，培育期间再补入卵子体积10-15倍量的新鲜海水，作为诱导组；

2）染色体诱导加倍

以对照组70-80％受精卵出现第一次卵裂痕的时间作为诱导组受精卵出现第一次卵裂痕的时间，在诱导组第一次卵裂痕出现前10-20min，将步骤1）诱导组受精卵置于静水压机加压容器内，在60-70MPa静水压下进行压力休克处理，处理6-8min后泄压，取出受精卵，置于海水中继续培育；

3）原肠胚和鱼苗四倍体率的测定：将诱导组的原肠胚进行染色体的倍性鉴定，并对孵化出的鱼苗进行流式细胞仪DNA含量的倍性鉴定，获得大菱鲆原肠胚期和鱼苗期四倍体率。

所述步骤1）和步骤2）中受精时期、孵育时期以及诱导时期三个时期所用海水的温度为13-18℃之间任意恒定的适宜大菱鲆卵生长所需水温；其中三个时期所用的海水温度应保持一致，且温差在±0.1℃以内。

所述将步骤1）诱导组受精卵置于静水压机加压容器内的时间为诱导组处理前1min左右。

本发明的优点和积极效果如下：