[发明专利]一种鱼糜制品中肉来源的检测方法

权利要求书

1.一种鱼糜制品中肉来源的检测方法，其特征在于：步骤一、DNA提取：用灭菌后的剪刀将鱼糜制品剪碎，称取1g鱼糜制品于15mL灭菌的离心管中，加入4mL的TE抽提液，匀浆；加入400μL10％SDS和80μL20mg/ml蛋白酶K充分混匀；将离心管置于65℃的恒温水浴槽中孵育，直至混合液消化至澄清为止；12000r/min离心30min，取上清液至新的离心管中，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1，缓慢颠倒混匀，12000r/min离心10min；取上清液至新的离心管中，加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，上下颠倒数次，12000r/min离心10min；弃去乙醇，吹干，获得DNA；然后加入100μL超纯水溶解，使用超微量核酸蛋白质测定仪，将DNA浓度稀释至100ng/μL左右作为模板； 

步骤二、多重PCR：多重PCR扩增采用50μL的体系，DNA模板1μL，含Mg²⁺的10×PCR缓冲液5μL，浓度为2.5mmol/L dNTPs mixture2μL，鸡肉特征引物Gg-F和Gg-R：鸭肉特征引物Ap-F和Ap-R：猪肉特征引物Ss-F和Ss-R＝2∶1∶1，所需的引物浓度均为10μmol/L，5U/μL TaqDNA聚合酶0.4μL，加超纯水补充至50μL；PCR扩增反应程序分为两部分，第一部分：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火40s，72℃延伸50s；以后每个循环依次降低0.5℃，直到52.5℃，共25个循环；进入第二部分，94℃变性30s，52℃退火40s，72℃延伸50s，12个循环；最后72℃延伸8min； 

步骤三、电泳检测：取5μL PCR产物与1μL预染液混合，预染2-3min，于1.0％的琼脂糖凝胶上进行点样，120V条件下电泳30min，然后，采用凝胶成像系统拍照； 

步骤四、结果鉴定：观察电泳结果，鸡肉、鸭肉和猪肉对应的扩增片段大小分别为187bp、333bp和515bp，如有上述大小的片段，则认为结果为阳性，样品中含用相对应的肉类成分，如无上述大小片段，则认为是阴性，样品中不含有鸡肉、鸭肉和猪肉。 

2.根据权利要求1所述的鱼糜制品中肉来源的检测方法，其特征在于：所述步骤一中的TE抽提液含有1.5％CTAB、0.05mol/L pH8.0的Tris-HCl、0.7mol/L NaCl、0.01mol/L pH8.0的EDTA。 

3.根据权利要求1所述的鱼糜制品中肉来源的检测方法，其特征在于：所述步骤二中鸡肉特征引物Gg-F和Gg-R各1μL，鸭肉特征引物Ap-F和Ap-R各0.5μL，猪肉特征引物Ss-F和Ss-R各0.5μL。 

4.根据权利要求1所述的鱼糜制品中肉来源的检测方法，其特征在于：所述步骤三中的预染液为6×Loading buffer：Genefinder核酸染料＝9∶1混合。 

5.根据权利要求1所述的鱼糜制品中肉来源的检测方法，其特征在于：所述引物的序列：鸡肉特征引物Gg-F：AGCAGGTGTTTCCTCCAT和Gg-R：GTTGCGGTCGGTAAGTAG，扩增片段187bp；鸭肉特征引物Ap-F：CATTCCTCCTTATACTCGC和Ap-R：ATGTGGTGTTTAGGTTTCG，扩增片段333bp；猪肉特征引物Ss-F：AACCCTACTTGGCGATGA和Ss-R：GTGTTCAGGTTGCGGTCT，扩增片段515bp。