[发明专利]焦磷酸测序技术检测贾第鞭毛虫的方法

权利要求书

1.一种焦磷酸测序技术检测贾第鞭毛虫的方法，其特征在于，首先依据贾第鞭毛虫磷酸丙糖异构酶(triose phosphate isomerase，tim)设计特异性引物及焦磷酸测序引物；再提取待测样品的脱氧核糖核酸(DNA)，然后分别以tim基因的特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增；用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，若引物扩增片段长度为165bp，则制备焦磷酸测序单链模板，再进行焦磷酸测序反应，最后根据PCR扩增结果和焦磷酸测序结果来判定样品中是否含有贾第鞭毛虫；所述的设计贾第鞭毛虫的特异性引物及焦磷酸测序引物是根据该虫的磷酸丙糖异构酶基因序列，选取保守序列，通过Assay Design SW软件设计特异性引物序列，以扩增出特异性单一条带，再根据扩增区域中包含的特异核苷酸序列(目标序列)设计焦磷酸测序引物以确证是否为贾第鞭毛虫；贾第鞭毛虫PCR及测序引物为：

tim基因上游引物5’-AATGTGTACCTAGAGGGGAACG-3’，5’进行生物素标记

tim基因下游引物5’-CTTTTCCAGGGCACGCTTA-3’，

tim基因测序引物5’-TCCAGGGCACGCTTA-3’；

贾第鞭毛虫磷酸丙糖异构酶的目标序列：GCCTTCTTGG CGCTTTGCTCGTCGGTCTCC；扩增片段长度为165bp。

2.根据权利要求1所述的焦磷酸测序技术检测贾第鞭毛虫的方法，其特征在于，所述的提取待测样品的DNA是利用人源贾第虫包囊的粪便经100目系统网过滤，滤液用酚-氯仿法抽提而得；或用商业化的DNA提取试剂盒提取。

3.根据权利要求1所述的焦磷酸测序技术检测贾第鞭毛虫的方法，其特征在于，所述的以贾第鞭毛虫tim引物进行PCR扩增：其中，上下游引物扩增是将提取的待测样品DNA进行PCR扩增，扩增溶液中加入2×PCR buffer(10倍聚合酶链式Mix反应液)12.5μL，10pmol/μL上游引物和下游引物各0.5μL，DEPC水补足体积至25μL，PCR循环条件为：94℃预变性5min后，进入94℃变性30s，46℃退火30s，72℃延伸30s，共循环50次；然后72℃再延伸10min。

4.根据权利要求1所述的焦磷酸测序技术检测贾第鞭毛虫的方法，其特征在于，所述的PCR扩增产物电泳检测：取2g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5μg/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3μL～6μLPCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果并记录。

5.根据权利要求1所述的焦磷酸测序技术检测贾第鞭毛虫的方法，其特征在于，所述的制备焦磷酸测序单链模板：使用50μl标记有生物素的PCR产物与200μg链霉亲和素包被的磁珠，在室温25℃下孵育20分钟，用vacuum prep tool将与磁珠结合后的PCR产物吸起，然后在70％乙醇中清洗5s；denatureation buffer(变性缓冲液)洗5s；最后移到washing buffer(冲洗缓冲液)中清洗10s；然后将vaccum prep tool放入含有测序引物的板中，摇动，释放磁珠。将样品放入80℃烘箱2分钟，再冷却到室温。

6.根据权利要求1所述的焦磷酸测序技术检测贾第鞭毛虫的方法，其特征在于，所述的焦磷酸测序反应：测序反应在室温下于焦磷酸测序仪上检测，加样使用600毫巴/8毫秒的加样压力和时间，每轮反应时间65秒，引物链随着不同dNTP的加入而延伸，随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，读出DNA序列。

7.根据权利要求1所述的焦磷酸测序技术检测贾第鞭毛虫的方法，其特征在于，所述的关于根据PCR扩增结果和焦磷酸测序结果来判定样品中是否含有贾第鞭毛虫：PCR反应为阳性的，进行焦磷酸测序分析，测序片段与tim基因目标片段完全相同的，确定为贾第鞭毛虫；PCR反应为阳性的，测序片段与目标片段有一个以上碱基不同判定为非贾第鞭毛虫；PCR反应为阴性的判定为非贾第鞭毛虫。