[发明专利]一种Micro RNA表达检测方法及其定量检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种Micro RNA表达检测方法及其定量检测试剂盒。 

背景技术

Micro RNA是近年来在多种真核细胞及病毒中发现的一类来源内源性染色体上的非编码单链RNA，长度为21～25nt的短序列，在进化上具有高度的保守性，能够通过与靶mRNA特异性的碱基互补配对，引起靶mRNA降解或者抑制其翻译，从而对基因进行转录后的表达调控（O`Donnell KA,Wentzel EA,Zeller KI,et al.e-Myc-regulated microRNAs modulate E2F1 expression[J].Nature，2005,4(7043):839.）。由于Micro RNA序列在不同的生物中具有一定的保守性，目前普遍认为Micro RNA的功能是参与生命的一些基本过程，如发育过程中的细胞增殖、细胞死亡、应激反应和脂肪代谢等，越来越多的证据表明Micro RNA在细胞中起着调控基因表达的重要作用。最近的研究发现Micro RNA与细胞的癌变有着极为密切的关系，已经发现Micro RNA与肺癌、结直肠肿瘤、伯基特淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病等肿瘤疾病有关（Meltzer PS.Cancer genemics:Small RNAs with big impacts[J].Nature,2005,435(7043):745.）。 

由于Micro RNA分子只有20-25nt左右大小，检测较为困难。以前主要采用的方法是Northern blot等杂交的方法进行检测，方法繁琐，不易成功，且Micro RNA极易降解，对于结果影响也较大。 

为了克服之前检测方法的缺陷，Allawi等建立了Invader Assay的方法(Allawi HT，Deahlberg JE，OlsonS,et al.Quantitation of Micro RNAs using a modified Invader assay.RNA,2004,10:1153-1161)，Liu等建立了寡核苷酸芯片方法(Liu C，Calmn GA，et al.An oligo nucleotide microchipfor  genome-wide micro RNA profiling in human and mouse tissues.PNAS，2004，101(26)：9740-9744)，这种方法提高了检测的敏感性及实用性，但这种方法需要荧光标记和荧光仪或芯片检测仪，而且由于micro RNA分子太小，应用也受到一定的限制。 

如今，对Micro RNA前体的检测主要是采用RT-PCR的方法(Schmittgen TD，Jiang J，Liu Q，et al.A high-throughput method to monitor the expression of Micro RNA precursors.Nucleic Acids Research．2004，32(4)：e43)，采用随机引物或与Micro RNA前体互补的引物直接进行反转录，但是这仅仅只能针对特异的Micro RNA，而且半定量的方法不能准确地表现出Micro RNA的表达量，所以该方法已经渐渐退出了Micro RNA分子的检测的行列。