[发明专利]一种快速鉴定鸭甲肝病毒血清型的双重RT-PCR方法

说明书

（一）技术领域

本发明所涉及一种用于快速鉴定鸭甲肝病毒血清型的双重RT-PCR方法，属于病毒分子生物学领域。

（二）背景技术

鸭甲型肝炎病毒(DuckhepatitisAvirus,DHAV)包括三个基因型和血清型：鸭甲肝病毒1型（DHAV-1）、鸭甲肝病毒2型（DHAV-2）和鸭甲肝病毒3型（DHAV-3），三个血清型之间几乎无交叉保护。近年来，我国鸭病毒性肝炎的病原日趋复杂化，研究表明目前大陆地区未检测到DHAV-2，但普遍存在DHAV-1和DHAV-3的混合感染，给养鸭业生产造成严重的经济损失。

目前鸭病毒性肝炎的鉴定主要依靠流行病学调查、临床症状和病理变化，但不同鸭甲肝病毒引起的鸭病毒性肝炎在流行病学、临床症状和病理变化方面极为相似，特别是两种或多种病毒混合感染时，依靠上述方法和手段难以确定病毒类型。有效控制鸭病毒性肝炎的关键是要明确鸭肝炎病毒的血清型，因此，加强鸭甲肝病毒不同血清型鉴定技术的研究对预防和控制鸭病毒性肝炎具有重要的现实意义。传统的病毒血清型鉴定需要分离培养获得纯化的病毒，通过单因子血清进行鉴定，这种方法费事费力，对于多重感染的鉴定难以进行。多重PCR方法在检测多种病原微生物感染时具有省时省力、简单快速、敏感、特异的优点，已在多种病毒的鉴定与检测中得到了广泛应用，但PCR方法鉴定的基础是依据病原的基因型来进行的。目前的研究表明，不同鸭甲肝病毒的基因型与血清型相对应，因此可以通过基因型的检测来完成对鸭甲肝病毒血清型的鉴定。目前我国鸭群中以DHAV-1和DHAV-3的单重及混合感染最为常见，应用多重RT-PCR方法检测鸭甲肝病毒的方法已有建立，但这些方法存在敏感性低（黄秋雪等，鸭甲肝病毒基因A型和C型双重RT-PCR检测方法的建立，2012，34（2）：120-123，最低检测灵敏度：DHAV-A为4.98×10⁴拷贝/μl和DHAV-C为1.68×104拷贝/μl；何冉娅等，Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒鉴别RT-PCR检测方法的建立，黑龙江畜牧兽医，2009，3:14-16，最低检测灵敏度：DHAV-A为0.8ng/μl和DHAV-C为1.0ng/μl），或者不能适用于目前生产中所有流行毒株的检测的缺点（Kim等，2008，Differential diagnosis between type-specific duck hepatitis virus type1(DHV-1)and recent Korean DHV-1-like isolates using a multiplex polymerase chain reaction，2008，Avian Pathology,37:171-177）。

（三）发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种快速鉴定鸭甲肝病毒血清型的双重RT-PCR方法，本发明设计并筛选了新的特异性引物，优化了反应过程中的各种参数，建立的针对鸭甲肝病毒的双重RT-PCR分型方法特异性强、敏感性更高，可以快速准确地进行DHAV-1和DHAV-3的鉴定。

一种快速鉴定鸭甲肝病毒血清型的双重RT-PCR方法，包括以下步骤：

A、通过对参考GenBank上已发表的DHAV-1和DHAV-3的序列进行比对，选择在DHAV-1和DHAV-3的多聚蛋白基因（polyprotein gene）的保守区分别设计一对针对DHAV-1的特异性引物SEQ1/SEQ2和一对针对DHAV-3的特异性引物SEQ3/SEQ4。

SEQ1：5’-CAA CTC GAC CAA TH(T/C/A)C CTG G-3’，

SEQ2：5’-CCT GR(A/G)T GR(A/G)A CCA TTG TR(A/G)A CTG-3’，

SEQ3：5’-GAAATC TGCACT CAATGGAGAG-3’，

SEQ4：5’-CCC AGG AAA TGA TTG GTC AG-3’。

所有引物以无菌ddH2O（Rnase free）配成25pmol/μl的浓度备用。