[发明专利]一种杉木遗传转化方法

权利要求书

1.一种杉木遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）转化受体的建立：

取继代3周的杉木胚性愈伤组织细胞，接种到杉木液体培养基中，23℃，85r/min的恒温摇床振荡培养；每7天继代一次，第三次继代后3天后即可用于农杆菌侵染；其中，杉木液体培养基为DCR基本培养基，附加10 mg/L Vc，0.1-2.0 mg/L GA，2-5mg/L ABA，0.5g/L CH，30g/L麦芽糖；

（2）农杆菌菌液制备：

活化EHA105菌液，挑取单菌落，再次活化，28℃、220r/min振荡培液体养至OD₆₀₀为0.6-0.8，用杉木液体继代培养基重悬菌体；

（3）侵染：

将菌液摇匀，取3mL菌液加到继代3天的杉木悬浮细胞中，静置1-3min后，置于23℃，85r/min的恒温摇床继续振荡培养16~36h；

（4）脱菌培养：

用无菌水数次洗菌，用杉木液体培养基重悬杉木愈伤，将重悬后的杉木愈伤以铺平板的方式转移到加有头孢霉素500mg/L的体胚诱导培养基上，其中每皿4-5mL；并放入23℃恒温培养箱暗培养；每隔21天继代一次，诱导30~60天；体胚诱导培养基为1/2DCR基本培养基，附加Vc 10 mg/L，GA 2-8 mg/L，肌醇2-10g/L，CH 0.5g/L，AC 2g/L，麦芽糖25g/L，水晶洋菜2.8g/L；

（5）筛选培养：

待杉木子叶胚成熟后，将其挑到DCR基本培养基上，在23℃下进行光照培养，培养基中加有200mg/L头孢霉素；21天后转移到加有100mg/L头孢霉素，20mg/L卡那霉素的DCR基本培养基上进行筛选培养，每21天继代一次。

2.根据权利要求1所述的杉木遗传转化方法，其特征在于，步骤（2）中，杉木液体继代培养基重悬菌体，菌液的OD₆₀₀为0.5。

3.根据权利要求1所述的杉木遗传转化方法，其特征在于，步骤（4）中，无菌水中含有500mg/L头孢霉素。

4.根据权利要求1所述的杉木遗传转化方法，其特征在于：所述的EHA105带有35S：GUS基因和NPT-Ⅱ基因。

5.根据权利要求1所述的杉木遗传转化方法，其特征在于：步骤（5）中，继代2次后，就可用于移栽。