[发明专利]一种诱导纤维堆囊菌表达制备埃博霉素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及抗肿瘤药物微生物发酵领域，更具体地，涉及一种诱导纤维堆囊菌表达制备埃博霉素的方法。

背景技术

埃博霉素(epothilone)是一类大环内酯类化合物，从粘细菌亚目的纤维堆囊菌菌株发酵液中可以分离埃博霉素，其主要组分为Epothilone A和B。它与紫杉醇具有相同的抑制肿瘤细胞生长的作用机制，并且对多重耐药肿瘤细胞和耐紫杉醇的肿瘤细胞均表现强大的抗癌活性。除具有活性方面的优势之外，埃博霉素具有较紫杉醇简单的化学结构和良好的水溶性，而且可以发酵法生产。埃博霉素分子结构如下： 

Epothilones A (R = H) and B (R = CH₃)

    由德国国家生物技术中心(GBF)的G. Höfle等人于1993年首次报道。至今国外已有六种埃博霉素类化合物进入了临床试验，大量的临床研究结果显示出该类化合物有极大的药用价值。目前，国内埃博霉素的研发还处于实验室水平，还存在生产菌株纤维堆囊菌发酵培养菌体容易聚集成球状，发酵周期长，埃博霉素表达效率低，产物分离纯化效率低等因素影响埃博霉素的工业化生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术中埃博霉素表达效率低的不足，提供一种诱导纤维堆囊菌表达制备埃博霉素的方法。

本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：

一种诱导纤维堆囊菌表达制备埃博霉素的方法，包括如下步骤：

S1. 发酵菌种的制备：将纤维堆囊菌菌种培养至纤维堆囊菌生物量为0.8~1.2×10⁹cfu/mL时，作为发酵菌种备用；

S2. 发酵培养：将S1中的发酵菌种加入发酵培养基中进行培养，当发酵液中纤维堆囊菌生物量大于等于10¹⁰cfu/mL时进行停止发酵培养，得发酵培养物；

S3. 诱导发酵培养：在S2中的发酵培养物中加入诱导组合物进行诱导发酵培养，得诱导发酵培养物；

S4. 分离诱导发酵培养物中的埃博霉素；

其中，S3中所述的诱导组合物包含如下重量百分比的组分：

5~15%甘油、1~10%色氨酸、1~10%半胱氨酸、1~5%酪氨酸、1~10%2,3~二氢吡喃和1~10%酵母提取物；

S3中所述的诱导组合物的添加量为发酵液的1~10（体积）%；

S3中所述的诱导发酵培养条件为：控制温度32~35℃，PH7.2~7.5，在搅拌、通气、光照条件下培养12~36h。

本发明通过在S3中添加上述配比的诱导组合物和在S3中所述的发酵培养条件结合，从多方面诱导调控纤维堆囊菌表达，使得纤维堆囊菌能够高效表达埃博霉素。

作为一种优选方案，S3中所述的诱导组合物包含如下重量百分比的组分：

8~12%甘油、4~8%色氨酸、3~7%半胱氨酸、1~3%酪氨酸、3~7%2,3~二氢吡喃和4%酵母提取物；

所述的诱导组合物的添加量为发酵培养物的3~7（体积）%。

作为一种进一步优选方案，所述的诱导组合物包含如下重量百分比的组分：

10%甘油、5%色氨酸、5%半胱氨酸、2%酪氨酸、 5%2,3~二氢吡喃、4%酵母提取物；

所述的诱导组合物的添加量为发酵培养物的5（体积）%。

作为一种优选方案，S3中所述的诱导发酵培养条件为：控制温度32~35℃，PH7.2~7.5，在搅拌速度为150~180rpm，通气量为0.5~0.8 V/ V·min，800~1000Lux光照条件下培养12~36h。

作为一种最优选方案，S3中所述的诱导发酵培养条件为：控制温度32℃，PH7.5，在搅拌速度为150rpm，通气量为0.8 V/ V·min，1000Lux光照条件下培养24h。

作为一种优选方案，S2中的发酵培养方法为：将S1中制备得到的发酵菌种按5~10（体积）%的接种量加入发酵培养基中，控制温度在25~30℃、PH6.8~7.0，搅拌，通气，培养至发酵液中纤维堆囊菌生物量大于等于10¹⁰cfu/mL。