[发明专利]猪Kobu病毒套式RT-PCR检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种用于检测猪Kobu病毒的套式RT-PCR引物，其特征在于，其包括如下引物：

（1）外向引物P1和P2，其序列分别如序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

（2）内向引物P3和P4，其序列分别如序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

2.一种用于检测猪Kobu病毒的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1所述的套式RT-PCR引物。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括RNA提取试剂、反转录试剂、猪Kobu病毒阳性对照和阴性对照中的一种或多种。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的RNA提取试剂包括样品裂解液、氯仿、DEPC-乙醇、异丙醇和DEPC-H₂O中的一种或多种；所述的反转录试剂包括反转录缓冲液、MgCl₂、dNTP、RNA酶抑制剂、随机引物、AMV、反转录酶和DEPC-H₂O中的一种或多种；所述的猪Kobu病毒阳性对照为猪Kobu病毒阳性样本的cDNA；所述的阴性对照为H₂O。

5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，其包括：

（1）RNA提取试剂，包括：

样品裂解液管、氯仿管、75%乙醇管、异丙醇管和DEPC-H₂O管；

（2）反转录试剂，包括：

RT预混液管：包括反转录缓冲液、MgCl₂、dNTP、RNA酶抑制剂、随机引物、AMV反转录酶和DEPC-H₂O；

（3）套式PCR试剂，包括：

外套PCR反应液管：包括PCR缓冲液、dNTP Mixture、Taq酶、如权利要求1所述的外向引物和ddH₂O；内套PCR反应液管：包括PCR缓冲液、dNTP Mixture、Taq酶、如权利要求1所述的内向引物和ddH₂O；

PCR阳性对照管：猪Kobu病毒阳性样本cDNA；和

PCR阴性对照管：DEPC-H₂O。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的套式PCR试剂包括：外套PCR反应液管：包括已添加过Mg²⁺的10×PCR缓冲液5μL，2.5mMdNTP Mixture4μL，5U/μL Taq酶1μL，20pmol/μL如权利要求1所述的外向引物各1μL，ddH₂O35μL，合计47μL；内套PCR反应液管：包括已添加过Mg²⁺的10×PCR缓冲液5μL，2.5mM dNTP Mixture4μL，5U/μL Taq酶1μL，20pmol/μL如权利要求1所述的内向引物各1μL，ddH₂O37μL，合计49μL；

PCR阳性对照管：猪Kobu病毒阳性样本4ng/μL cDNA3μL；和

PCR阴性对照管：DEPC-H₂O 3μL。

7.一种用于检测猪Kobu病毒的方法，其特征在于，其是一种采用套式RT-PCR检测猪Kobu病毒的方法，其包括如下步骤：

（1）提取样品的总RNA；

（2）以步骤（1）提取的总RNA为模板，经RT反应获得cDNA；

（3）以步骤（2）所得的cDNA为模板，经套式PCR反应后，检测反应产物；

其中，步骤（3）所述的套式PCR反应包括：

外套PCR反应，所述外套PCR反应的引物为如权利要求1所述的外向引物，所述外套PCR反应的条件为：①94~95℃，3~5min，②93~94℃，35~45s，③58~60℃，30~40s，④70~73℃，35~45s，步骤②至④共30~36个循环，⑤70~73℃，7~10min；

内套PCR反应，所述内套PCR反应的引物为如权利要求1所述的内向引物，所述内套PCR反应的条件为：①94~95℃，3~5min，②93~94℃，30~40s，③58~60℃，30~40s，④72℃，30~40s，步骤②至④共25~35循环，⑤70~73℃，7~10min。