[发明专利]16种高危型和5种低危型HPV检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于第三类医疗器械-分子诊断领域，涉及一种使用多重不对称PCR方法，结合荧光探针对15种高危型及5种低危型HPV进行分型的方法及试剂盒。 

背景技术

人类乳头瘤病毒(HPV)感染分为良性和恶性感染，仅感染人类宿主,大约100多种HPV亚型已经得到基因组全序列。依据造成恶性肿瘤的潜在能力不同，可以分为高危性和低危型两种。低危型的HPV感染和多种临床症状有关，高危型HPV病毒是造成子宫颈癌的主要元凶。世界卫生组织及国际癌症研究署均确认HPV是引起宫颈癌的最主要病因，99.7%的宫颈癌患者都能发现高危型HPV感染。2004年国际癌症研究署发表研究称：“HPV感染是宫颈上皮内瘤变及宫颈癌发生的必要因素，可以认为，没有HPV持续性感染的妇女几乎没有患宫颈癌的危险。”这句话基本上可以归结为这样一个等式：高危型HPV+长时间持续感染（一般为10-15年）=宫颈癌。 

    宫颈癌的早期筛查方式是采用巴氏涂片以及改进后的液基薄层细胞学技术（TCT），这些方法只能从细胞学病变的角度来评估宫颈癌的发病情况，也就是说，要等到遭受病毒感染的细胞开始出现明显变化时才可以检测出来。 

随着对HPV感染导致宫颈癌的认识加深，以及分子诊断技术的发展，HPV基因检测作为宫颈癌的一种筛查手段得到了更广泛的应用。分子检测方法比较传统的细胞学检测方式，不需要等到细胞出现变化时才分辨出HPV感染，可以在病毒感染细胞但尚未出现症状的潜伏期，在病毒感染的最早期阶段筛查出这一病毒，从而达到早预防早治疗的目的。 

    目前主要有两种分子手段来检测HPV感染: 聚合酶链式反应 (PCR) 扩增编码病毒外壳的 L1 基因, 此基因在HPV亚型中高度保守；第二种是Hybrid Capture II 试剂盒 (HCII; Digene, Gaithersburg, MD, USA), 这种试剂盒检测13种高危型HPV亚型,包括： 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 以及 68. HCII 可以测定病毒载量, 但是不能分型. 因为高危型HPV和肿瘤病变级别有很大的关系, 确定高危型后,继续对高危型HPV进行亚型确定对于感染高危性HPV的妇女健康管理具有较大意义。高危型分型一般PCR后使用PGMY线性杂交，或者LIPA的线性杂交，定位于L1基因，可以精确区分不同的亚型。 然而，这些试剂盒都一定的缺陷，通量不高，不能自动读取结果，人工操作的部分太多，这样对于宫颈癌的筛查极为不利，意味着浪费大量的人力物力，而且扩增后需要开管操作，实验室潜在的污染是个很大的问题。 

    Luminex（xMAP）平台是液相杂交平台，其技术原理为用不同配比的两种红色分类荧光染料将直径为5.6微米(或6.5微米)的聚苯乙烯微球染成不同的荧光色,从而获得多达100种荧光编码的微球.把针对不同待测物的抗体分子或者基因探针以共价交联的方式结合到特定的编码微球上,每个编码微球都对应相应的检测项目.先把针对不同待测物的荧光编码微球混合,然后加入待测物质或者待测的扩增片段,所形成的复合物再与标记荧光素发生结合反应.微球在流动鞘液的带动下单列依次通过红绿激光,红激光用来判定微球的荧光编码,绿激光用来测定微球上报告分子的荧光强度.从而达到快速准确的定量检测目的.这种平台和HPV检测连用起到了很好的作用，解决了通量问题，可以自动判读。但是Xmap机器价格很高，不利于推广使用。 

   迫切的需要一种技术，即可以解决通量问题，又便于推广使用，在此需求基础上，我们把MAP PCR和荧光探针结合起来，可以一次性检测20种HPV病毒亚型，包括15种低危型及5种高危型HPV亚型，整个过程耗时2.5小时,易于操作，不需要开管，降低了污染。 

发明内容

1.本发明目的在于提供一种方法和试剂盒，这种试剂盒可以检测 20 HPVs ；其中15 种高危型包括：16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68 ；5 种低危型包括 6, 11, 40, 55, 70 。 

2.本试剂盒提供的方法可以在2管内完成这20种HPVs的分型检测，全程闭管检测，不需要开盖检测，极大的降低了实验室污染情况，而且操作简单。 

3.本试剂盒运用将MAP多重pcr和荧光探针结合起来，形成一种在荧光平台多重检测的方法。具体包括引物设计使用MAP引物设计方法，将引物分为三段式引物，其中5个次黄嘌呤可以在序列的特定位置。