[发明专利]使用细胞内同步表达法在T4噬菌体表面展示外源蛋白大分子的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物化学及分子生物学领域，具体涉及一种使用细胞内同步表达法在T4噬菌体表面展示外源蛋白大分子的方法。

背景技术

T4噬菌体的衣壳表面有两种修饰蛋白，分别为Hoc蛋白和Soc蛋白。此二蛋白为非必要蛋白，即删除或改造此二蛋白不会对T4噬菌体的复制和扩增造成影响。基于此二蛋白分子的这一特点，并通过分子生物学手段，可将外源蛋白（即非T4噬菌体自身的蛋白）与Hoc或Soc蛋白重组，并展示在T4噬菌体表面。通过分子生物学手段在T4噬菌体表面展示外源重组蛋白的技术，已在疫苗开发方面显示出巨大的潜在应用价值。

现有的T4噬菌体表面展示技术为体外展示技术。该方案以分子克隆的手段构建Hoc或Soc蛋白与外源蛋白融合的重组蛋白的表达质粒，在表达菌体内大量过表达外源重组蛋白。然后以色谱法分离纯化过表达的外源重组蛋白，并与Hoc蛋白和Soc蛋白缺失的T4噬菌体在缓冲液中结合。之后通过差速离心法将未结合的外源重组蛋白与T4噬菌体颗粒分离，从而得到衣壳上展示了外源重组蛋白的T4噬菌体颗粒。现有的T4噬菌体表面展示技术以体外展示为主要手段。这一技术涉及外源重组蛋白的过表达和分离纯化，然后再以Hoc蛋白或Soc蛋白缺失的T4噬菌体与之结合。这个过程会面临：1）外源重组蛋白过表达的表达量问题；2）重组蛋白的溶液可溶性及分离纯化效率问题；3）已纯化的外源重组蛋白与T4噬菌体表面在缓冲液体系中的结合效率问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种方法设计合理、可操作性强的使用细胞内同步表达法在T4噬菌体表面展示外源蛋白大分子的方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种使用细胞内同步表达法在T4噬菌体表面展示外源蛋白大分子的方法，其特点是，其步骤如下：

（一）带有T4噬菌体天然调控区的Hoc蛋白或Soc蛋白与外源蛋白融合的重组蛋白的表达质粒的构建：

（1）将Hoc蛋白或Soc蛋白的基因编码区与所需展示的外源蛋白的基因编码区融合，并在序列上游加入T4噬菌体控制Hoc蛋白或Soc蛋白表达的天然调控区域；外源蛋白选自任意蛋白；融合后形成带有调控序列的编码Hoc蛋白或Soc蛋白与外源蛋白融合的重组蛋白的基因序列；含有此序列的质粒在大肠杆菌细胞内会在T4噬菌体感染装配的过程中同步表达外源重组蛋白；

（2）制备包含质粒复制所需区域和抗生素抗性基因的基因片段；依据所需要的抗性基因和质粒复制区序列，选择合适的商业可获得的质粒载体，并通过PCR的方法扩增所选择的质粒载体的抗性基因和质粒复制所需区域；PCR的方法为：根据所选择的质粒载体的序列，在质粒复制所需区域和抗性基因的上下游选择合适区段设计PCR引物；PCR引物的设计基于PCR反应所设计的一对引物覆盖整个质粒复制所需区域和抗性基因；然后使用质粒载体的DNA为模板，使用标准的Taq酶并按照Taq酶设定的标准PCR循环进行PCR操作；

（3）以DNA连接酶按照商业公司提供的标准方法将从以上步骤获得的抗生素抗性基因和质粒复制所需区域以及Hoc蛋白或Soc蛋白与外源蛋白融合的重组蛋白的基因片段连接起来，并通过标准的化学转化法将其转化进入XL10-Gold感受态细胞内；培养细胞，进行质粒扩增，即得到带有T4噬菌体天然调控区的Hoc蛋白或Soc蛋白与外源蛋白融合的重组蛋白的表达质粒；

（二）将外源重组蛋白的表达质粒转化进入大肠杆菌细胞内：以传统的生物化学方法制作大肠杆菌细胞的感受态细胞，并将外源重组蛋白的表达质粒以标准的化学转化方法转化进入大肠杆菌感受态细胞内；

（三）以Hoc蛋白和Soc蛋白缺失的T4噬菌体病毒株感染含有外源重组蛋白表达质粒的大肠杆菌细胞：将含有外源重组蛋白表达质粒的大肠杆菌细胞在37摄氏度摇床中以180-270转/分钟的摇速培养至细菌细胞密度1.5-6×10⁸/毫升LB培养基，然后以MOI感染复数= 0.1-1.0用Hoc蛋白和Soc蛋白缺失的T4噬菌体感染细胞，并在37摄氏度摇床中以180-270转/分钟的摇速培养3-4个小时；个过程中，T4噬菌体不断装配扩增，与T4噬菌体装配同步表达的外源重组蛋白已经展示在T4噬菌体衣壳上；