[发明专利]烟草中核黄素的分析鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及卷烟检测分析技术领域，更具体地，涉及一种烟草中的核黄素的分析鉴定方法，尤其涉及采用液相色谱-电喷雾线性离子阱多级质谱分析方法分析鉴定烟草中的核黄素。

背景技术

核黄素，即维生素B₂，是一种水溶性化合物。核黄素具有多种生物学和生理学功能，是维持人体健康不可缺少的微量营养素，例如，缺乏核黄素会引起口腔发炎、舌炎、角膜发炎等。烟草中的核黄素早在50年代末被发现，核黄素在烟草相关领域的研究引起不少学者和研究机构的关注，它可作为体内抗氧化剂，有利于阻止烟气中的硝酸盐的转化，也可作为体内感光剂进行抗体催化氧化降解尼古丁。

近期刘菲等用核黄素处理烟草悬浮细胞研究发现，核黄素处理后提高了烟草悬浮细胞PAL、POD 活性，积累了更多与抗病有关的次生代谢产物。

因为烟草中核黄素含量较低，对于烟草样品中本身存在的核黄素的仪器分析鉴定方法一直以来却没有报道，更未见烟草样品中核黄素的定量检测报道。

液相色谱是分析核黄素的常用方法，但将液相色谱法其应用于烟草样品时，因为烟草中核黄素含量低，且烟草样品基质复杂，需要进行繁杂的样品前处理，且可能存在共流出现象。近些年来，随着液相色谱与质谱联用技术（LC-MS）的不断成熟与普及，LC-MS在定性定量分析中都得到了相当广泛的应用。Leporati等用三重四极杆串联质谱分析了多种水溶性维生素，但三重四极杆串联质谱只能在二级质谱水平上获取离子碎片信息，定性分析能力有限。

随着烟草质量和消费要求的不断提高，满足烟草制品的质量、产品研究需要，建立灵敏、准确、快速鉴定烟草中核黄素的方法已经成为本技术领域亟待解决的技术难题。

发明内容

 本发明的目的是克服现有核黄素分析检测技术的不足，尤其是烟草样品中核黄素分析鉴定技术的不足，提供一种烟草中核黄素的定性分析鉴定方法，本发明采用液相色谱-电喷雾线性离子阱多级质谱分析鉴定烟草中是否含有核黄素。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种烟草中核黄素的分析鉴定方法，是采用液相色谱-电喷雾线性离子阱多级质谱法获取烟草样品核黄素的色谱图，包括以下步骤：

S1.样品液准备；

称取0.25 g 烟末，加入25 mL 0.1 mol/L 盐酸后在95℃水浴中摇荡1小时，冷却后加入20 mL 2 mol/L醋酸铵，用水定容至50 mL即得待测烟草样品溶液，以待测烟草样品溶液制备不同浓度梯度的进样液； 

配制核黄素的甲醇溶液作为储备液，避光保存在2℃下；配制核黄素的水溶液作为工作标准溶液，核黄素的浓度为4μg核黄素/mL水。

S2.将进样液经0.2 μm滤膜过滤后直接进样，采用液相色谱-电喷雾线性离子阱多级质谱法进行分析检测；

液相色谱条件为：

安捷伦Eclipse XDB-C₁₈ column (50 mm × 2.1 mm, 1.8 μm)色谱柱，流动相为甲醇 : 0.1%甲酸 = 40% : 60%（体积比），所述甲酸的浓度0.1%为体积百分比浓度；使用安捷伦Zorbax C₁₈保护柱 (12.5 mm × 2.1 mm，5 μm)，等梯度淋洗，流速200 μL/min，柱温30℃，进样环5μL，全环进样。

电喷雾线性离子阱多级质谱的质谱条件为：

毛细管温度：350℃；喷雾电压：5 kV；鞘气：31 LTQ单位；辅助气：5 LTQ单位；最大离子注射时间300 ms；分离宽度 2 m/z；全扫描模式定性；采用电喷雾离子化（ESI）方式。

优选地，S1所述储备液，避光保存在2℃下。

优选地，S1所述工作标准溶液用完立即避光保存于2℃下，可以每两天配制一次；

优选地，S2所述直接进样优选采用注射泵直接进样。

所述以待测烟草样品溶液制备不同浓度梯度的进样液的不同浓度梯度可以根据具体实际需要进行确定，例如进样液浓度可设置梯度为80ng/mL、320ng/mL、960ng/mL、2000ng/mL、4000ng/mL。

本发明的有益效果是：

    烟草样品的样品基质与其他样品基质显著不同，而且烟草中的核黄素含量是极低的，现有技术中没有关于其检测分析的技术报道，也得不到相关的技术启示。本发明首次从液质联用分析的角度确证了核黄素是烟草本身含有的一种微量成分，拨开了蒙在本技术领域技术人员眼前的迷雾。