[发明专利]光谱学测定在脂立方样品中膜蛋白稳定性的方法

权利要求书

1.一种光谱学测定在脂立方样品中膜蛋白稳定性的方法，其特征在于，其步骤如下：

（1）表达和纯化目标蛋白；在NCBI网站上输入目标膜蛋白名称搜索序列，得到目标膜蛋白的全长基因序列；将全长序列导入相关细胞表达系统，然后进行纯化，得到纯化后的膜蛋白溶液；

（2）将膜蛋白溶液混入脂立方样品；

①将纯甘油一油酸酯或者甘油一油酸酯与下述脂类分子中的一种组成的混合物从-20℃的冰箱取出中，加热至37-40℃后形成液态；前述脂类分子选自1,2 - 二油酰-sn-甘油-3 - 磷酸胆碱，1,2-二油酰-SN-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺，1,2-二油酰-sn-甘油基-3 - 磷脂酰甘油，1,2-二油酰-SN-甘油基-3-磷脂酰丝氨酸或者胆固醇；其中，纯甘油一油酸酯占混合物质量的90%以上；

②将液态甘油一油酸酯或者混合物转移到玻璃针管中冷却至20-24℃，并立即与膜蛋白溶液混合得到膜蛋白溶液样品，将膜蛋白溶液样品推过注射器的连接器以形成均匀的脂立方样品；脂立方样品中膜蛋白的最终浓度为0.5-2.0毫克/毫升，脂立方样品中水的重量百分比为38-42％；同时以不含前述膜蛋白的缓冲液作对照；

③当一个均匀和透明的脂立方样品形成后，将50-70微升的脂立方样品转移到石英比色皿中，密封；在5600×g和18-22℃的条件下离心；

（3）膜蛋白在脂立方样品中的稳定性测定；

采集石英比色皿中脂立方样品的初始吸光度和内在蛋白荧光光谱后，立即对样品进行升温，升温采用5-10℃为一升温梯度循序进行，每一梯度升温进行后，需要采用前述方法离心并进行吸光度和内在蛋白荧光光谱采集；升温的最高温度不超过100℃；以不含膜蛋白的缓冲液按前述方法进行对照；将采集的吸光度和内在蛋白荧光光谱一起以图表画出，即可得到蛋白的退火温度；退火温度越高说明膜蛋白温度性越高，反之亦然；从而实现膜蛋白稳定性的测定。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述的甘油一油酸酯与脂类分子混合物采用以下方法配制：将甘油一油酸酯与所述的脂类分子按比例置于适量的氯仿中，使用氮气流蒸发大部分溶剂，随后在真空21-23℃下处理至少12小时，除尽其余的残留氯仿后，在-20℃下储存。