[发明专利]深绿木霉菌株B8-1-34在制备漆酶方面的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株深绿木霉B8-1-34菌株制备漆酶方面的应用，属于微生物技术领域。

背景技术

真菌漆酶是一种糖蛋白，由肽链、糖配基和Cu²⁺三个部分组成。分子量在60~390kDa 之间。肽链一般由500~550个氨基酸组成，糖配基主要有氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖和阿拉伯糖，占整个分子重量的10%~80%。糖配基组成及含量的不同是漆酶分子量存在较大差异的主要原因。由于漆酶具有底物多样性，因此，具有广泛的工业应用价值和潜力。如添加到酒类制品、果汁、饮料及食用油中可抗氧化；添加到洗涤剂中可提高洗涤效果，还可用于纸浆生物漂白，废水处理，环境污染物脱毒与降解，以及染发剂。此外，还可用于聚合和氧化反应的催化剂或促进剂等。

漆酶可由多种真菌产生，包括子囊菌类（如曲霉属、链孢霉属和柄孢壳菌属）、半知菌类葡萄孢属、担子菌类（如金线菌属、屈孔菌属、 香菇属、灰侧耳菌属、栓菌属）和丝核菌属。木霉属菌株可产生纤维素酶、几丁质酶和木聚糖酶等多种具有生物活性或重要工业应用价值的酶。然而，利用木霉属菌株发酵产漆酶鲜有报道。法国学者Savoie研究了木霉对7株叶腐担子菌和7株木腐担子菌漆酶合成能力的影响，木霉使酶活均有所提高。Baldrian 以木霉与云芝共培养产生的酶活比对照提高40倍，达44.2U/L; Mata 报道以咖啡果肉为基质共培养平菇和木霉，酶活从150U/g 提高到180 U/g。CN200610037937.1 公开了利用栓菌AH28-2和木霉ZH1共培养生产漆酶的方法，发酵9.5天，漆酶产量达6000U/L。Hanen Chakroun等人以葡萄糖为碳源并加入适量铜离子培养深绿木霉，漆酶产量可达到661U/L; U. Holker研究了深绿木霉产漆酶的影响条件，其中，当pH=4.5时酶活最高，为7U/L。

发明内容

本发明的目的是利用保藏号为CGMCC No. 6390的深绿木霉B8-1-34（TrichodermaatrovirideB8-1-34）菌株高产量地制备稳定性好的漆酶。

为实现本发明目的，本发明利用深绿木霉B8-1-34（TrichodermaatrovirideB8-1-34）菌株通过液态发酵法生产漆酶，通过调整培养基成份提高漆酶产量。该菌株是以木糖渣为唯一碳源，从自然界中筛选出，经分子鉴定，结合形态学特征确定该菌株为深绿木霉（Trichodermaatroviride），进一步经过诱变选育获得。已于2012年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No. 6390。

具体制备方法如下：

⑴将保藏号为CGMCC No. 6390的深绿木霉B8-1-34经活化后，制成浓度为10⁶～10⁸/ml的孢子悬液，按1～10%的接种量接入种子培养基中，26～32℃，150～220rpm摇床中培养24-48h，得种子液；种子培养基：PDA液体培养基，121℃高压灭菌25 min；

⑵将步骤⑴制得的种子液以2～15%接种量接入发酵产酶培养基中，裝液量为30～60mL/250mL, 26～32℃，150～220rmp摇床中培养； 

⑶培养48～120h，固液分离制备粗酶液，或将制得的粗酶液浓缩后，经过常规提取得到固体酶制剂。

步骤（2）所述的发酵产酶培养基由以下组份组成：碳源0.5～5%，氮源0.5～5%，磷酸二氢钾0.01～0.4%；七水硫酸镁0.002～0.10%；氯化钾0.002～0.10%，各组分以重量百分比计，余量为蒸馏水；并加入CuSO₄ 和微量元素，使培养基中CuSO₄ 50～500μmol/L，微量元素液1～5mL/L。

所述的碳源为甘油、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、果糖、乳糖、山梨糖、甘露糖、可湿淀粉、玉米秸秆其中之一或两种以上成份的混合。

所述的氮源为酵母提取物、蛋白胨、麸皮、豆饼粉、玉米浆、碳酸氢铵、酒石酸铵、磷酸氢二铵、硫酸铵、氯化铵、酒石酸铵、硝酸铵其中之一或两种以上成份的混合。

所述的碳源优选果糖、甘露糖和蔗糖、可湿淀粉其中之一或两种以上成份的混合。

所述的氮源优选蛋白胨、酵母提取物、硝酸铵、磷酸氢二铵其中之一或两种以上成份的混合。