[发明专利]一种同步检测十三种腹泻病毒的试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及腹泻病毒的检测试剂盒及其检测方法，尤其是涉及一种基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的同步检测十三种腹泻病毒的试剂盒及其检测方法。

背景技术

腹泻是一种发病率高并流行于世界各地的胃肠道传染病，其发病率仅次于上呼吸道感染，病毒性腹泻是我国的常见病和多发病，病因比较复杂，尤对婴幼儿人群危害更大，因此亟需建立腹泻病毒快速高效的诊断方法。

目前，腹泻病毒的传统检测方法主要包括以下几种：

（1）粪便常规检查：粪便常规检查法是根据大便性状、粪便镜检、发病年龄及流行季节估计最可能的病原体。光镜镜检时，黏液便、脓血便或血便，可有多量红、白细胞，多见于沙门菌、侵袭性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、弯曲菌、耶尔森菌等细菌和某些病毒等所致的腹泻；稀便、水样便，可有少量或无红、白细胞，多见于肠产毒性大肠杆菌、轮状病毒、隐孢子虫、气单胞菌等所致的腹泻，具有成本低，对实验室硬件要求低的优点，但是存在如下缺点：1）灵敏度低，常出现假阴性；2）准确性较低，易造成错诊或误诊。

（2）病原学检查：即直接做影像及活组织检查，或病原体分离培养，之后在显微镜、电镜下观察，做出诊断。优点：成本低；对实验室硬件要求低。缺点：1）耗时长：一般需3-5天或更长；2）诊断效率低：只能单菌纯培养；对一些表型特征变异的病原体，用形态学经验很难辨别；此外，由于抗生素的滥用，细菌在检测过程中生长受到抑制，导致假阴性的结果；3）工作量巨大：由于对每个抽检样品的每种菌都必须进行检测，工作量非常巨大，特别是部分对培养环境要求较为苛刻的菌，更加大了检测的工作量和难度。

（3）血清学检查：应用最广泛的是酶联免疫技术（ELISA）:一般先用一抗与抗原发生特异性结合，然后用通用的酶标记的二抗与一抗发生特异性结合，再将酶显色，之后观察结果。优点：1）样品通量较高：利用96孔酶标板，一块平板可完成多个样品的检测；2）较敏感，利用酶联的特性，可将原来的抗原信号放大；3）快捷：在时间上，比传统的培养基微生物培养检查法要缩短很多；但也存在如下缺点：1）易出现假阳性：由于洗涤和抗原包被的操作，或由于抗原表面决定簇类似而发生交叉反应，故易出现假阳性；2）耗时耗力：制作抗体是非常耗时耗力的工作；3）灵敏度不确定：实验的灵敏度取决于抗体的好坏，而每个抗体的好坏不一，质量难以控制；4）无法检测多变异的病毒：变异性较快的病毒，如一些RNA病毒，存在多种亚型，并且经常变异，变异导致抗体失效，无法检测抗原。

（4）分子生物学——PCR检测方法：目前经常应用的有实时荧光定量PCR、免疫PCR、反转录PCR等，都是针对病原体的特异性靶基因进行检测。其中，荧光定量PCR检测方法最为成熟。荧光定量PCR技术的优点：灵敏性高，并可精确定量，在对李氏杆菌、沙门氏菌、肉毒杆菌、大肠杆菌等的检测中都取得了良好效果。2004年，中国发布了实施荧光定量PCR检测禽流感H7亚型的国家标准。2009年，美国FDA批准了用荧光定量PCR检测猪流感H1N1亚型的试剂盒。但也存在如下缺点：1）通量低：一次只能检测一个病原成分，如需要检测多种病原菌，就需要多台PCR仪同时工作，效率低，周期长，对大批量的多种病原污染的样品更是无从下手；2）成本相对较高：因一次只能检测一个病原体，当一个样品同时需要检测多种病原菌时，必须一个一个检测，成本相对增高。

（5）分子生物学——基因芯片法：基因芯片是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段（基因探针），有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。优点：1）高通量并行检测：当一个样品同时需要检测多种病原菌时，一次实验即可得出全部结果；2）操作简便快速：整个检测只需4-8小时基本可以出结果；但也存在如下缺点：1）技术成本昂贵、复杂：每个样品需要一个芯片，成本大于￥1000/样品，不利于大规模推广；2）探针的合成与固定比较复杂，特别是制作高密度的探针阵列，是主要的限速步骤；3）不能精确定量，重复性差；4）灵敏度较低：芯片法需核酸量较大，一般须先做多重PCR扩增，由于引物较多，容易自身产生二聚体，发夹结构，或由于Tm值不同，而导致扩增目的片段效率不同，进而影响检测的灵敏度；5）由于芯片的种类较多，难以制定一个统一的质量控制标准。