[发明专利]一种促生抑菌解淀粉芽孢杆菌、调理剂制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物在农业方面应用技术，主要涉及解淀粉芽孢杆菌调理剂制备方法及其应用。

背景技术

随着设施农业的快速发展，连作和大量使用化肥农药，使设施土壤养分失衡，土壤酸化，土传病害频繁发生，严重制约了设施生产的可持续发展。

目前，针对设施生产中土壤修复、植病防控已有多种应用微生物生产的制剂，如：CN100999667公开了一种设施菜地土壤改良剂及其制备方法与应用，强调作为土壤改良剂，菌剂中菌种的配比和固体菌剂载体的配比，菌剂单独发酵活菌数仅为10亿/ml。CN101948771A公开了防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌及其应用，强调在NYD培养液中可获得菌数20～40亿/ml发酵液，有2种抗菌物质，菌液稀释50倍，处理水稻种子，对水稻恶苗病温室防效达到84.6％以上。上述两种制剂中，前者发酵液菌数偏低，用量和成本必然加大；后者处理种子用浓度也较高，用量和成本也不低。如果能将发酵菌液的活菌数和活性提高，减少使用量，降低生产成本，将大大节约能源和资源，利国利民。

发明内容

本发明的目的是提供一种解淀粉芽孢杆菌制备的促生抑菌调理剂，该调理剂制备所用材料成本低廉，发酵产物效价高；并且产生多种促生抑菌物质。该调理剂可以在土壤和植物体内定殖；对多种植物土传真菌性病害具有良好的防控效果和明显的促生长作用。该调理剂的生产使废弃物资源化，生产工艺简单，无“三废”排出；减少或替代化学农药的使用，安全无毒，属环境友好型制剂，符合生态农业和可持续农业发展的需求。

为实现上述本发明的目的，本发明的技术方案是：

1.本发明为一株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens.sp）Pb-4(T4,4),菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址:中国,北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮政编码:100101，保藏编号为CGMCCN0.7155，保藏日期为2013年1月18日。

解淀粉芽孢杆菌的获得过程与特征

解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)获得过程：该菌株是本发明人从太原市小店区永昌乳业奶牛养殖场的牛粪中分离获得的。其分离过程：采集新鲜牛粪，称取粪样10g，放置在装有玻璃珠的90ml无菌水中，剧烈振荡10分钟，静置5分钟。吸取牛粪稀释液20ul,滴入马铃薯葡萄糖（PDA）琼脂平板上，距离平板中央2.3cm处，3个直径4mm无菌滤纸片上。然后在平板中央接种番茄枯萎病病原真菌。置28℃恒温培养5d，逐日观察记载抑菌效果。挑选抑菌明显的滤纸周围单菌落若干。按上述步骤，逐个验证其抑菌效果。选抑菌效果最佳的菌株，反复纯化后，保存于液体石蜡斜面试管中。

菌体形态特征：解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)为革兰氏阳性菌，好氧生长，杆状，长为3.0μm～3.3μm，宽为1.0μm～1.2μm，内生芽孢，有鞭毛；在肉汁琼脂培养基上形成乳白色菌落，皱褶，边缘不整齐。经16SrDNA同源性系列分析：在GenBank数据库中比对结果显示，PB-4(T4,4)菌株属于芽孢杆菌属；与解淀粉芽孢杆菌聚为一群，具有98%、99%的相似性，确定PB-4(T4,4)菌株为解淀粉芽孢杆菌。

菌株生理生化反应：解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)葡萄糖发酵实验阳性、淀粉水解实验阳性、明胶液化实验阳性、V.P反应阳性、接触酶反应阳性、甲基红反应阳性、硝酸盐还原实验阳性、柠檬酸盐利用阳性；可在pH值为6.0～9.0生长，适宜生长温度为25～39℃。PB-4(T4,4)培养物，经121℃高压灭菌10min和100℃恒温水浴10min,相对未经热处理的培养物，仍有80%以上的抑菌活性。

2.本发明提供解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)调理剂的制备方法

（1）菌种活化：取液体石蜡中冷藏保存的解淀粉芽孢杆菌PB-4(T4,4)，划线接种于蛋白胨15g、酵母膏5g、葡萄糖5g、琼脂斜面培养基（PYJ）上，28～36℃培养30～48h，连续转管2次使菌种得到活化。备用。

（2）种子液培养：将活化菌种接种于装有100mlPYJ培养液的250ml三角瓶中，30～35℃，150～200r/min，恒温培养15～20h作为种子液。备用。