[发明专利]一种D-氨基酸氧化酶的突变体酶蛋白及其制备方法

权利要求书

1.一种D-氨基酸氧化酶的突变体酶蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其中：

（1）SEQ ID No.1所示的D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列中第115位的谷氨酸（E）突变为丙氨酸（A）；

（2）SEQ ID No.1所示的D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列中第119位的天门冬酰胺（N）突变为天门冬氨酸（D）；

（3）SEQ ID No.1所示的D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列中第286位的苏氨酸（T）突变为丙氨酸（A）。

2.一种编码如权利要求1所述突变体酶蛋白的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种制备如权利要求1所述突变体酶蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）根据NCBI数据库中公开的来自原玻璃蝇节杆菌的D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列，在与同源蛋白的氨基酸序列比对的基础上确定突变位点；设计定点突变的突变引物对；

所述的115位的突变引物为：

115位anti-sense：5′-CCTCCCGGGCGGATCTGC-3′；

115位sense：    5′-GGCAGATCCGCCCGGGAG-3′；

119位突变引物为：

119位anti-sense：5′-TCTGCCGGACGGCGCCCAC-3′；

119位sense：    5′-TGGGCGCCGTCCGGCAGAT-3′；

   286位突变引物为：

286位anti-sense：5′-GAGCACGTCGCGGGCCAC-3′；

286位sense：    5′-GTGGCCCGCGACGTGCTC-3′；

（2）以携带D-氨基酸氧化酶基因的载体为模板，使用上述设计的引物，利用快速PCR突变技术，构建115/119/286三个氨基酸位点突变的突变质粒；

（3）将上述突变质粒转化可表达目的基因的工程菌中，随工程菌的复制表达该突变体酶蛋白。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（2）中表达载体为pET系列中的任意一种。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（3）中工程菌为BL21(DE3)。

6.根据权利要求1所述突变体酶蛋白的应用，其特征在于用于对D-甲硫氨酸、D-苯丙氨酸、D-精氨酸、D-赖氨酸、D-丙氨酸、D-亮氨酸、D-鸟氨酸、

D-缬氨酸、D-脯氨酸和D-组氨酸中D-氨基酸的定性定量检测。