[发明专利]一种TAT-LBD-NEP1-40融合蛋白、构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于蛋白转导领域，具体涉及将LBD引入TAT-NEP1-40融合制备TAT-LBD-NEP1-40融合蛋白。同时，本发明还涉及TAT-LBD-NEP1-40融合蛋白穿过血脑屏障并富集于缺血区，用于中枢神经系统损伤的治疗。

背景技术

创伤、中风、脑出血、脊髓损伤等具有高死亡率和高致残率的特点。如何降低神经功能受损程度和如何更好地使受损神经元功能得到更好地改善，提高患者的生存质量，对患者及其家庭、社会都有重要意义，是一个世界性的难题。目前，对于CNS损伤引起的神经功能障碍尚无有效治疗药物。因此，寻找新型有效的治疗脑CNS损伤药物是研究热点。

以往普遍认为成年哺乳动物中枢神经系统（central nervous system,CNS）损伤引起的神经功能障碍难以恢复的主要原因为神经元不能再生。近二十年来的研究已有突破性进展，目前认为CNS再生困难的原因除促进再生的营养因子不足外，另一重要的原因是中枢的抑制性再生环境。近几年来，主要抑制受损神经再生的基因－Nogo及其受体(Nogo receptor,NgR)的发现，为CNS损伤的研究掀开了新的一页，被誉为是“探索中枢神经损伤修复漫长道路中的一个里程碑”。新近Neuron发表的研究，应用基因敲除(knockout)技术，发现敲除Nogo-A和NgR改善脊髓损伤后再生和可塑反应，应用NgR拮抗剂(NgRecto)治疗，促进轴突再生和脊髓损伤的功能恢复。同样应用Nogo-A抗体(IN-1,7B12)和NgR拮抗剂(NgRecto)治疗，显著改善MACO导致的行为学结果，促进轴突可塑性。为此，Lee等在《Nature Review Drug Discovery》撰写“Targeting the Nogo receptor to treat central nervous system injuries”的论文，提出“NgR as a drug discovery target”，认为以调控NgR为治疗目标，可大大促进CNS损伤后神经元的功能恢复，逆转其灾难性的后果。目前NgR成为CNS损伤领域的研究热点和关注焦点，认为阻断它可影响脑缺血的发展和结果，促进和增强神经功能恢复。

Nogo-66是Nogo-A分子胞外的袢状结构，与NgR结合从而触发下游信号通路阻断神经的再生。NEP1-40(Nogo extracellular peptide residues1-40)是Nogo-66氨基端40个残基组成的多肽，保留有Nogo-66与NgR结合的能力，但不触发下游的信号转导途径。NEP1-40作为NgR拮抗剂已经应用于脊髓损伤动物模型，可以促进皮质脊髓轴突的生长和5-羟色胺能神经纤维的出芽，并上调轴突生长蛋白SPRR1A以及突触的形成，可以显著促进实验动物运动功能的恢复。NEP1-40作为NgR拮抗剂，具有高选择性和有效性使其有望成为治疗脊髓损伤、脑外伤、中风和慢性进行性多发性硬化等轴突再生障碍性疾病的新药。然而，目前研究中所使用的NEP1-40都是经化学合成，其成本较高，且由于血脑屏障(BBB)、血脊屏障、细胞膜等的存在，大于6个氨基酸的多肽一般不能穿过这些屏障，而达不到有效的药物治疗浓度，目前主要是通过显微定位注射或植入微型泵等手术的形式给药。显微注射存在诱发脑内出血等潜在危险，并且只能维持短时期；植入微型泵较好，但存在难以通过血脊屏障、血脑屏障的问题，使NEP1-40的进一步研究和临床应用受到了极大的限制。目前，已通过应用TAT蛋白转导技术研制出的新型蛋白TAT-NEP1-40融合蛋白可顺利通过血脑屏障，减小脑缺血损伤。但是，TAT蛋白靶向性较差，进入脑内后广泛分布，不能集中作用于缺血损伤部位。因此，如何使TAT-NEP1-40靶向作用于CNS损伤部位成为现今研究的重点。

层粘连蛋白Laminin是CNS重要的胞外基质。在缺血性脑损伤时，laminin在缺血区域内高表达（Liebkind RTE.,et al.，2007），因此，其可成为治疗蛋白聚集于缺血损伤区域的一个潜结合靶向区域，明显增强药物浓度和治疗效率，使治疗蛋白更有效的发挥靶向治疗损伤神经元的作用。集聚蛋白（Agrin）是神经肌肉接头突触后分化的一个关键分子，层粘连蛋白和集聚蛋白的氨基端（N-terminal domain of agrin，NtA)有很强的亲和能力，NtA可以作为与层粘连蛋白结合的结构域。有研究显示：通过构建含有神经营养因子BDNF和层粘连蛋白结合区域NtA的融合蛋白，可以靶向聚集于脑缺血损伤区域，并且高效、持续的发挥BDNF的治疗作用，而对正常组织和细胞没有任何副作用（Han,Q.,et al.,2011）。