[发明专利]基于固定化酶原位高效酶解法的蛋白鉴定及质谱成像的方法

说明书

技术领域

本发明属于生化分析领域，涉及一种基于固定化酶原位高效酶解法的蛋白鉴定及质谱成像的方法，具体涉及一种固定化酶原位酶解组织切片实现蛋白鉴定并应用于质谱成像的新方法。

背景技术

现有技术公开了基于生物质谱的组织成像技术作为质谱技术中的一个新领域在迅速发展。它通过直接扫描组织表面，结合专业的图像处理软件，将扫描产生的离子信号通过数据处理与图像重建，获得组织中化合物的组成，相对丰度及分布情况。该技术已广泛应用于探测组织切片中的小分子类物质、脂类、多肽和蛋白质的分布，能够确定病变组织和正常组织中不同部位的特定分子位置及相对含量，能够跟踪药物及其代谢产物的空间分布，因此越来越受到国内外科学家的关注。然而，在分析分子量较大的蛋白时，因其较低的离子化效率和检测灵敏度，质谱成像技术依然存在一些困难和挑战。现阶段，成像技术中使用的质谱仪器多与飞行时间质量分析器连用，随着被分析物分子量的增大，其灵敏度随之下降，且分辨率不足以直接完成对蛋白的鉴定。

现有技术中，发展了用高浓度的有机溶剂处理切片表面以提高成像技术中对蛋白质的检测效率的方法，但是其操作复杂耗时，易造成切片中蛋白的移位。在传统蛋白质组学研究中，将蛋白酶解成肽段可使其更易于质谱检测。现阶段的原位酶切技术是将酶液滴点在组织切片上，在适宜的温度和时间内，将蛋白质在其原有位置上酶切成若干肽段的一项新技术。目前该方法的条件仍有待优化：过高的胰酶量产生的自切肽段将影响低丰度蛋白质的检测。而胰酶的量过低，因切片厚度非常薄，蛋白含量很低造成不能被有效酶切。因此，亟需发展一种更高效，更便捷的原位酶解的新方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种步骤简单、操作方便、快速高效的原位酶解方法， 具体涉及一种基于固定化酶原位高效酶解法的蛋白鉴定及质谱成像的方法，该方法结合固定化酶的技术，在短时间内快速酶切组织切片上的蛋白，并应用于质谱成像。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

1.选择合适的胰蛋白酶固定化材料。

2.利用材料与胰蛋白酶的相互作用将胰酶固定。

3.固定化酶在组织切片上原位酶解后进行质谱分析。

4.利用图像重构软件实现组织切片上蛋白分布的确定。

具体的，本发明的基于固定化酶原位高效酶解法的蛋白鉴定及质谱成像的方法，其特征是，选用合适的纳米材料作为胰蛋白酶吸附剂，利用其高效的酶解效率实现组织切片原位酶解及蛋白鉴定并应用于质谱成像，其包括步骤：

（1）将离体的组织切片用导电胶带固定于质谱靶板上；

（2）依次用不同浓度的乙醇溶液润洗切片表面，每次润洗一分钟；

（3）将胰蛋白酶与氧化石墨烯材料按照事宜比例，在磷酸缓冲溶液中混合，4摄氏度条件下孵育；

（4）将固定化酶用25mM碳酸氢铵溶液稀释后均匀铺展在组织切片上，并放入37摄氏度恒温箱，至组织切片表面的溶液完全蒸发；

（5）配制含三氟乙酸和乙腈水溶液配制成CHCA基质溶液，用基质覆盖仪将基质溶液均匀喷洒在组织切片上，待基质完全干燥后送入质谱仪进行成像分析；

（6）将扫描结果导入成像软件中，通过图像重构技术处理，选择合适的肽段得到组织切片中蛋白分布的质谱成像图。

本发明中，组织切片的厚度通常为14μm。

本发明中，依次用50%，75%，100%的乙醇溶液润洗切片表面。

本发明中，润洗时间为1分钟。

本发明中，材料与胰蛋白酶的浓度为400ng/μL。

本发明中，磷酸缓冲溶液浓度为20mM（pH5）。

本发明中，其特征是混合比例为1:1。

本发明中，是4摄氏度条件下孵育5分钟。

本发明中，将固定化酶用25mM碳酸氢铵溶液稀释10倍。

本发明中，是CHCA基质溶液（5mg/mL,0.1%三氟乙酸50%乙腈）用基质覆盖仪将基质溶液均匀喷洒在组织切片上。

本发明方法中，优选的具体条件是：

1.组织从负80摄氏度转移至冷冻切片机，冷冻切片机操作温度为负18摄氏度，获取厚度为14μm的组织切片，并用导电胶带固定于质谱靶板上。

2.依次用50%，75%，100%的乙醇溶液润洗切片除去脂类等干扰物质，每次润洗一分钟。