[发明专利]一种同一切面多靶点蛋白免疫组化或免疫荧光标记的方法

说明书

技术领域

本发明属于病理学领域，具体地，本发明涉及一种同一切面多靶点蛋白免疫组化或免疫荧光染色标记的方法。

背景技术

肿瘤标志物是肿瘤细胞在恶变、产生、发展、浸润、转移等过程中产生的与肿瘤细胞生长代谢密切相关的生理活性物质。它们往往仅见于胚胎组织，不存在极少存在于正常成人组织，但是在成人肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织里的含量，通过检测其在相应的细胞或组织中的存在及其浓度的变化，确定不知来源的转移肿瘤的原发肿瘤，可进行肿瘤及其特性的诊断、分类，手术、化疗、放疗的监测，同时给据治疗前后指标的变化，进行评估患者的预后、治疗效果。肿瘤标志物作为病理诊断的依据，对提高临床肿瘤确诊水平具有重要的参考价值。目前随着科学的发展，肿瘤标志物的研究越来越深入，其对肿瘤细胞的生理意义得到逐步的揭示，同时，特异性强的新肿瘤标志物的发现，成为目前肿瘤研究中的一个重要的方向。

随着研究的深入，肿瘤标志物的分类越来越精确，多项肿瘤标志物的联合应用，可大大提高检测的效率和准确率。目前组织的病理诊断标准主要是依据免疫组化技术，通过HE染色和一项肿瘤标志物的染色，进行肿瘤的诊断。鉴于免疫组化染色的颜色分类的缺陷，目前还无法实现在一张组织切片进行多标记物的鉴别。如果采用连续切片，在不同切片上进行肿瘤标志物的染色标记，虽然能实现多肿瘤标记物的识别，但是由于切片的自身厚度带来的缺陷，使得同一位点的不同标记物染色可能处在不同的细胞上，无法完全准确的反应同一细胞内的不同标志物水平。

肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSC）是肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞，是肿瘤难以治愈的重要原因。近年来对CSC研究的深入以及干细胞分离技术的进步，使人们对恶性肿瘤有了新的认识，并且发现CSC在肿瘤的发生、生长、浸润、复发和转移中起重要作用。通过分离纯化CSCs，可以对其生物学特性如异质性肿瘤的演化、转移和抗药性机制等进行研究；鉴定CSCs 的基因图谱，寻找 CSCs 的特异性靶位，研制新型针对CSCs 的药物。对其特性研究的深入有助于阐明CSCs在肿瘤形成、 生长、 浸润、复发和转移中的作用机制，进而寻找彻底杀死 CSCs 的方法以达到最终治愈肿瘤的目的，为肿瘤的临床治疗展现一个全新视角，为肿瘤靶向治疗找到新靶点，使治愈肿瘤成为可能。至今研究人员已先后从乳腺癌、脑肿瘤、前列腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺癌、肝癌等恶性肿瘤中成功分离出肿瘤干细胞。肿瘤干细胞的成功分离使得肿瘤学领域的研究跨入CSCs研究时代。

肿瘤干细胞的分离鉴定主要赖于CSC特有的表面分子标记物的识别和区别于普通肿瘤细胞的生物学特性。肿瘤干细胞表面分子标记有两类：一种是正常干细胞/祖细胞的标记。如 CD133，Nanog等。研究发现在人肝癌细胞株和原位肝癌组织中存在CD133+细胞。另一类CSC标记可能是与肿瘤的发展、转移有关的标记，如 EpCAM、CD90⁺、CD45⁺。目前，通过抗体介导识别细胞表面特异受体的方法来实现分别肿瘤细胞、肿瘤干细胞的方法，主要有流式细胞仪细胞仪和免疫荧光法。

目前上述需要多抗原标记的技术还很难用免疫组化技术实现，目前同一切片上最多可进行两种抗体的标记，即通过标记辣根酶标记产生棕色和标记碱性磷酸酶产生蓝紫色来区分，但二者颜色的区分和技术操作上都有一定的困难，同时应用两种不同酶标记抗体进行免疫组化染色的应用极少。而免疫组化技术是医院病理科应用最成熟的技术，如何实现多抗原、多目标蛋白在切片的同一切面上进行免疫组化标记，对病理学的诊断的发展具有重要的作用。本发明提供了一种可在切片的同一切面上进行多靶点免疫组化标记的方法与技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同一切面多靶点蛋白免疫组化或免疫荧光染色标记的方法，本发明方法实现了多抗原、多目标蛋白在切片的同一切面上进行免疫组化的染色标记，对病理学的诊断的发展具有重要的作用。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一种同一切面多靶点蛋白免疫组化或免疫荧光染色标记的方法，是对组织蜡块进行切片时，取连续的两张切片，采用载玻片捞片时，第一张切片的背面朝上，紧接第二张捞片时正面朝上，即用于染色的两个组织切片表面属同一切面。

对属同一切面的两张切片，分别进行不同靶点蛋白的免疫组化或免疫荧光染色，观察时，取对应的同一区域的组织染色结果进行重合比较，实现同一细胞或组织位点多靶点蛋白的存在分析。