[发明专利]一种快速建立葡萄遗传转化再生体系的方法

说明书

技术领域

本发明属于新植物技术领域，具体涉及葡萄转基因育种技术领域。

背景技术

培育葡萄新品种、改善果实品质、提高植株抗性是葡萄科研工作者十分关注的问题，但是葡萄基因数量大且多呈杂合状态，遗传背景复杂，利用传统的方法进行杂交育种，培育过程繁琐，周期较长，成本较高，效率较低，通过杂交获得优良品种的方法容易受到亲本材料的限制，杂交过程常常带入不良的经济性状，受到很大程度的制约。组织培养技术、分子生物学和基因工程技术的迅速发展，为葡萄新品种选育和品质改良研究开辟了新的途径。利用转基因手段培育葡萄优良品种，改善葡萄的农艺学性状，同时提高果实产量具有十分广阔的前景和极其重要的现实价值。

目前葡萄的遗传转化方法主要包括基因枪法和根癌农杆菌介导的Ti质粒法。基因枪法具有一次处理可使许多细胞转化的优点，但是获得单拷贝整合的植株比较困难，转基因植株的遗传特性较复杂，稳定性差，转基因植株的表达困难，易出现沉默现象等。根癌农杆菌介导的方法转化效率较高，可以导入的DNA片段较大，导入基因拷贝数低，表达效果较好，方法和使用的仪器简单，费用较低，是目前转化机理研究最清楚，使用最广泛，技术最成熟的方法。

以愈伤组织为受体材料进行基因遗传转化研究具有很多优势。第一，已分化的细胞均回复到脱分化的分生细胞水平，易于接受外源基因，转化效率较高；第二，扩繁量大，获得的转化愈伤组织通过继代扩繁培养，能够分化出更多的转化植株；第三，多种组织、器官均可诱导愈伤组织，外植体试材广泛。

发明内容

本发明的目的在于克服已有技术的不足，利用根癌农杆菌介导的方法，使用葡萄花药诱导胚性愈伤组织进行转化，既结合了农杆菌转化的优点，又克服了其他转化方法周期长，转化体少的缺点，通过本专利所描述的方法，以gfp为报告基因快速得到了酿酒葡萄品种雷司令的转基因苗，提高了葡萄的转基因育种效率。

本发明通过以下技术方案实现：

转基因的方法：利用组织培养诱导酿酒葡萄品种雷司令花药获得的愈伤组织，经继代培养筛选获得胚性愈伤组织，以所获得胚性愈伤组织作为受体，通过根癌农杆菌介导的方法，利用选择培养基筛选获得抗性愈伤组织，再生葡萄植株，经分子检测及体式荧光显微镜观察，获得转基因葡萄苗。根据该转基因方法，其特征在于共培养前将农杆菌加入到抗性诱导培养基中进行活化，可显著提高转基因效率。OD₆₀₀＝1.0的菌液浓度侵染葡萄胚性愈伤组织能获得较高的抗性愈伤率。抗性诱导培养基配方为：5g L^-1牛肉浸膏、1g L^-1酵母膏、5g L^-1蛋白胨、5g L^-1蔗糖、4g L^-1MgSO₄·7H₂O、100μmol L^-1乙酰丁香酮、50mg L^-1卡那霉素、50mg L^-1利福平，调节pH为5.2。继代培养20天的胚性愈伤组织转化效率最高。胚性愈伤组织和农杆菌在含有100μmol L^-1乙酰丁香酮的液体共培养基中侵染处理20分钟，可以顺利脱除愈伤组织上附着的根癌农杆菌，而不影响胚性愈伤组织的生长，液体共培养培养基配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg L^-1盐酸硫胺素、0.2mg L^-1盐酸吡哆醇、0.5mg L^-1烟酸、150mg L^-1肌醇、50mg L^-1水解酪蛋白、10g L^-1椰乳、5％蔗糖、100μmol L^-1乙酰丁香酮、1mg L^-1NOA、90g L^-1甘露糖醇，pH为5.2。农杆菌和愈伤组织共培养温度为28℃，固体共培养基成分为：MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg L^-1盐酸硫胺素、0.2mg L^-1盐酸吡哆醇、0.5mg L^-1烟酸、150mg L^-1肌醇、50mg L^-1水解酪蛋白、10g L^-1椰乳、5％蔗糖、100μmol L^-1乙酰丁香酮、1mg L^-1NOA和0.28％脱乙酰吉兰糖胶；共培养三天后使用液体继代培养基清洗，可显著降低愈伤组织褐化程度，提高转化效率，液体继代培养基配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg L^-1盐酸硫胺素、0.2mg L^-1盐酸吡哆醇、0.5mg L^-1烟酸、150mg L^-1肌醇、50mg L^-1水解酪蛋白、10g L^-1椰乳、5％蔗糖、100μmol L^-1乙酰丁香酮、1mg L^-1NOA、1g L^-1头孢霉素和100mg L^-1二硫苏糖醇；选择培养基配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg L^-1盐酸硫胺素、0.2mg L^-1盐酸吡哆醇、0.5mg L^-1烟酸、150mg L^-1肌醇、1.0mg L^-1P-CPA，0.20mgL^-1TDZ，0.5mg L^-1NOA，0.01mg L^-1GA₃、50mg L^-1水解酪蛋白、2.0mg L^-1甘氨酸、.10g L^-1椰乳、200mg L^-1头孢霉素、50mg L^-1卡那霉素、5％蔗糖和0.28％脱乙酰吉兰糖胶，pH6.2；分化培养基配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg L^-1盐酸硫胺素、0.2mg L^-1盐酸吡哆醇、0.5mg L^-1烟酸、150mg L^-1肌醇、1.0mg L^-1P-CPA，0.20mg L^-1TDZ，0.5mg L^-1NOA，0.01mg L^-1GA3、5mg L^-1的天冬氨酸、2.0mg L^-1甘氨酸、10g L^-1椰乳、5％蔗糖和0.28％脱乙酰吉兰糖胶，pH6.2；所述生根培养基成分为1/2MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.1mg L^-1盐酸硫胺素、0.8mg L^-1盐酸吡哆醇、0.5mg L^-1烟酸、100mg L^-1肌醇、0.5mg L^-1α-萘乙酸钠、0.5mg L^-1NOA、50mg L^-1水解酪蛋白、2.0mg L^-1甘氨酸、3％葡萄糖和0.28％脱乙酰吉兰糖胶，pH6.2。