[发明专利]人类免疫缺陷病毒1型一步法荧光定量PCR检测试剂盒

权利要求书

1.一种人类免疫缺陷病毒1型一步法荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：本发明通过考察人类免疫缺陷病毒1型基因组全序列，并对检索所得HIV-1各个基因型一致性保守序列，根据该保守序列设计出一对HIV-1特异性引物、一条HIV-1特异性荧光探针和一条内参探针，采用实时荧光定量PCR方法扩增目的基因。

2.权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒1型一步法荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）RNA特异性PCR扩增的基因序列和内参基因序列分别为：

〈SEQ ID No.1〉

5’-GGCTGTTGGAAATGTGGCAAGGAAGGACACCAAATGAAAGAKTGTACTGAGAGACAGGCTAATTTTTTAGGGAAAATCTGGCCTTCCCACAAGGGGAGGCCAGGGAATTTTCTTCAGAACAGACCAGAGCCAACAGC-3’，

〈SEQ ID No.2〉

5’-GGCTGTTGGAAATGTGGCAAGGAAGGACACCAAATGAAAGAKTGTACTGAGAGACAGGCTAATTTTTTAGGGAAAATCTGGCCTTCCACCAATTGGTTCCTCTCTGGTGTTCTTCAGAACAGACCAGAGCCAACAGC-3’，

人类免疫缺陷病毒1型荧光定量检测试剂盒扩增基因序列全长137 bp，属HIV-1 gag结构基因区，为单拷贝序列；内参基因序列全长137 bp，仅与扩增基因中的探针序列有所不同。

3.如权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒1型一步法荧光定量PCR检测试剂盒，一对HIV-1特异性引物序列中的一条序列与SEQ ID No.1中所示的序列相同，另一条序列与SEQ ID No.1中所示的序列互补；HIV-1特异性探针与SEQ ID No.1中所示的序列互补：其中，所述的一对HIV-1特异性引物，其序列可以选自SEQ ID No. 3和SEQ ID No.4，

〈SEQ ID No.3〉为：5’-GGCTGTTGGAAATGTGG-3’，

〈SEQ ID No.4〉为：5’-GCTGTTGGCTCTGGTCTG-3’；

一对HIV-1特异性引物序列也可以是上述序列向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上；所述的HIV-1特异性探针，可以选自SEQ ID No.5的序列，〈SEQ ID No.5〉为：5’-FAM-AATTCCCCGGCCTTCCTTTGTTG-TAMRA-3’，

其中探针5’-端标记FAM荧光基团，探针3’-端均标记淬灭基团；HIV-1基因片段特异性探针序列也可以是上述序列向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上；所述的内参探针，可以选自SEQ ID No.6的序列，〈SEQ ID No.6〉为：5’-JOE-CCACCAATTGGTTCCTCTCTGTG-TAMRA-3’，其中探针5’-端标记JOE荧光基团，探针3’-端均标记淬灭基团；内参基因序列也可以是上述序列向前或向后延伸10~20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上。

4.如权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒1型一步法荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：试剂盒包括以下成分：RT-PCR反应液、RT-PCR酶混合物、引物探针、阴性对照、强阳性对照、弱阳性对照、校准品1号~5号：其中，所述的RT-PCR反应液为Tris-HCl (pH8.3) 20 mM、KCl 100 mM、明胶0.2 mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.4 mM、MgCl2 6 mM的混合液；所述的酶混合物为逆转录酶、Taq DNA聚合酶和UNG酶的混合物（逆转录酶3 U/ul，Taq DNA聚合酶2 U/ul，UNG酶1 U/ul）；所述的引物探针为一对HIV-1特异性引物、一条HIV-1特异性探针和一条内参探针的混合液（引物各6.25 uM，HIV-1特异性探针2.5 uM，内参探针2.5 uM）；所述的阴性对照为无HIV-1 RNA的正常人血清；所述的强阳性对照为高浓度的含有HIV-1基因片段的慢病毒的人血清；所述弱阳性对照为低浓度的含有HIV-1基因片段的慢病毒的人血清；所述校准品1号~5号为已知浓度梯度的含有HIV-1基因片段的慢病毒的人血清。

5.如权利要求1中所述的人类免疫缺陷病毒1型一步法荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的RT-PCR反应液的配制和扩增程序如下：

a、一步法荧光定量RT-PCR反应液的配制：

将RT-PCR反应液、RT-PCR酶混合物、引物探针按照12.5: 0.5: 2的比例混合，反应液体积为25 ul；

b、一步法荧光定量PCR反应程序：

[1] 37℃10 min

[2] 50℃15 min

[3] 95℃ 2 min

[4] 94℃ 10 s

[5] 60℃ 45 s

[6] Go to [4] ，45 cycles

在第五步采集FAM和JOE通道荧光信号，

[7]End。