[发明专利]牛体外胚胎两段培养方法

权利要求书

1.牛体外胚胎两段培养方法，该方法首先将牛受精卵在含0.12～0.16mM葡萄糖的SOF液中培养2～3天，然后在含1.8～2.2mM葡萄糖的SOF液中培养4～5天。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法首先将牛受精卵在含0.15mM葡萄糖的SOF液中培养2天，然后在含2mM葡萄糖的SOF液中培养5天。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，培养条件均为含5%CO₂的空气，温度39℃，饱和湿度。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，该方法还包括在牛受精卵培养前进行牛卵母细胞体外成熟和体外受精的步骤。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，卵母细胞体外成熟的方法是：将挑选出的A、B级卵丘卵母细胞复合体在洗卵液中清洗3次，成熟液清洗2次，然后放入预先在CO₂培养箱中平衡2h以上的成熟培养液中培养，培养条件为含5%CO₂的空气，温度39℃，饱和湿度，培养时间为24h。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，体外受精的方法是：采用培养皿微滴法，首先将成熟的卵母细胞在受精液中清洗2-3次后放入平衡好的受精液中；然后采用上浮法处理冷冻精液，精子在洗精液上浮20-30min，然后取上清600-800μl放入1.5ml离心管离心2次，离心后除去上清加入洗精液最终体积为250μl，取50μl处理后的精液加入已放入卵母细胞的受精液中，精子终浓度为1×10⁶精子/ml，培养条件为5%CO₂的空气，温度39℃，饱和湿度，受精时间为8h。

7.一种用于牛体外胚胎培养的试剂，其包括A液：含0.12～0.16mM葡萄糖的SOF液；和，B液：1.8～2.2mM葡萄糖的SOF液。

8.根据权利要求7所述的试剂，其特征在于，所述A液为含0.15mM葡萄糖的SOF液。

9.根据权利要求7或8所述的试剂，其特征在于，所述B液为含2mM葡萄糖的SOF液。