[发明专利]一种适合教学与科研使用的NK细胞活性检测方法

权利要求书

1.一种NK细胞活性检测方法，由淋巴细胞分离、NK细胞的制备、靶细胞的制备、细胞毒试验步骤组成，其特征在于：NK细胞的制备的步骤，将分离的淋巴细胞置于细胞培养瓶中于25~37℃孵育1小时。

2.根据权利要求1所述的一种NK细胞活性检测方法，其特征在于：细胞毒试验步骤：采用SDS-二甲基甲酰氨溶液或HCl-异丙醇溶液终止反应。

3.根据权利要求2所述的一种NK细胞活性检测方法，其特征在于SDS-二甲基甲酰氨溶液为含有10% SDS和50%的二甲基甲酰氨。

4.根据权利要求1所述的一种NK细胞活性检测方法，其特征在于：淋巴细胞分离步骤：用生理盐水代替Hank’s液洗涤细胞。

5.根据权利要求1所述的一种NK细胞活性检测方法，其特征在于：细胞毒试验步骤：每个样本每次取2～3个效靶比例，效靶比例范围为10:l～50:1。

6.根据权利要求1所述的一种NK细胞活性检测方法，其特征在于：

  1) 淋巴细胞分离：无菌抽取静脉血2 mL→注入含有肝素的无菌试管中摇匀，加入2 mL PH7.2 Hank’s液进行对倍稀释，混匀→然后用吸管吸取稀释后的血液沿试管壁缓缓加到含有2 mL淋巴细胞分离液的试管中，使稀释血液缓慢逐层叠加在分离液之上，并与分离液形成明显的界面，2000r/min离心20min→小心取出试管，然后用平口吸管小心吸取中层呈白色雾状的淋巴细胞层→用Hank’s溶液洗涤两次，每次1500r/min离心10min，弃上清液→加RPMI-1640培养液1mL混匀，取少许进行细胞计数及活力测定；

2) NK细胞的制备：利用淋巴细胞分离液从抗凝血中分离出单个核细胞，经 RPMI-1640细胞培养液洗涤3次，置于细胞培养瓶中于25~37℃孵育1小时，以去除其他单核细胞，然后调整细胞浓度为2×10⁶个/mL备用；

3) 靶细胞的制备：取细胞培养的对数生长期的K562细胞，经RPMI-1640细胞培养液洗涤3次，调整细胞浓度为2×10⁵个/mL；

4) 细胞毒试验：取上述效应细胞和靶细胞悬液各50μl→加到96孔细胞培养板内混匀，同时设单独效应细胞对照孔和单独靶细胞对照孔，每个样本做3个复孔，于37℃，5%CO₂饱和湿度条件下孵育4小时→然后加入MTT溶液每孔l0μl，继续孵育4小时→加SDS-二甲基甲酰氨100μl，置37℃ 14～18小时后，待其充分溶解后→在酶标仪上测定光密度值测定波长为570nm~630nm→然后计算和分析结果。