[发明专利]金银花p-香豆酰酯3’-羟化酶基因LjC3’H 及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种金银花p-香豆酰酯3’-羟化酶基因LjC3’H及其应用。 

背景技术

植物次生代谢是指有些生物体利用某些初生代谢产物为“原料”,在一系列酶的催化下,形成一些特殊的化学物质的过程,这些特殊的化学物质即为次生代谢产物,如生物碱、黄酮类、萜类、有机酸、木质素等,它们是植物中一大类并非生长所必需的小分子有机化合物,但对于植物自身在复杂环境中的生存和发展却起着不可替代的作用。 

植物次生代谢产物具有重要的经济价值。临床应用的药物,有很多都是取自植物的次生代谢产物。西方的临床药物中,大约25%是直接或间接地从植物中提取的次生代谢物。在我国，药用植物的应用历史更为悠久。此外,用作食品调味剂、日用芳香剂、杀虫剂等的植物次生代谢产物也倍受人们的青睐。 

随着基因工程技术的不断完善，对植物细胞代谢网络进行修饰和改造来积累大量目的产物已成为可能。目前，次生代谢产物关键酶基因的克隆及转化是植物次生代谢工程的研究热点。应用关键酶基因的代谢工程为提高植物组织、细胞培养及整体植株代谢产物的产量提供了技术平台。 

植物次生代谢产物种类繁多,生物合成途径也千差万别,只有在了解目标植物特定次生代谢途径的基础上,才能有选择地进行有效的基因操作。因此，植物次生代谢图谱的研究是植物次生代谢基因工程必要的前提工作。 

中草药是中国传统的药用植物，其有效成分绝大多数都来源于次生代谢产物，在植物中含量甚微，利用栽培措施大幅度地提高有效成分含量难度很大。通过次生代谢的基因工程，来提高中药材有效成分含量的研究刚刚起步。有效成分相关基因的克隆及其功能鉴定的有效方法还较少，且耗时，所获得的次级代谢途径中的相关基因较少。 

山东道地药材金银花(Lonicera japonica Thunb.)是忍冬科忍冬属（Lonicera）植物，具有抑菌、抗病毒、解热、抗炎、保肝、止血、抗氧化、免疫调节等作用。含有多种生物活性成分：挥发油成分类、芳樟醇、棕搁酸、黄酮类化合物类（木犀草素、忍冬昔等）、绿原酸类（绿原酸和异绿原酸、咖啡酸及棕搁酸等）、三萜皂苷类（忍冬苦苷A和忍冬苦苷C）、p-谷甾醇等。一般认为绿原酸类化合物是金银花主要有效成分。绿原酸在清除自由基、水果和蔬菜的酶促褐变以及抗真菌和抗虫等方面具有重要功能。因此，提高绿原酸含量对改善金银花品质具有重要意义。 

绿原酸的生物合成属于植物的苯丙素类代谢途径。植物通过该途径合成了大量重要的次生代谢物质。羟基肉桂酸是木质素合成的中间产物，决定细胞壁的合成及物理化学性质。同时，羟基肉桂酸还是众多挥发类物质合成的前体，这些物质在植物化感作用中具有重要功能。咖啡酸和阿魏酸酯是植物体内重要的抗氧化物质。由苯丙烷生成的其它物质还参与了植物应对环境的生物和非生物胁迫,例如二苯乙烯和类黄酮都是重要的植物抗毒素。 

苯丙素类物质的生物合成至少需要两步羟化反应。首先是苯环的4号碳原子由肉桂酸羟化酶(C4H)催化羟化。C4H功能在植物中比较容易测定，是最早鉴定的P450家族成员之一。 第二步羟化反应发生在苯环的3号碳原子，由p-香豆酰酯3’-羟化酶(C3’H)催化。目前对C3’H的功能和酶活特性还不完全清楚。有研究表明C3’H是依赖抗坏血酸、NADPH或者黄素的氧化酶。另有学者认为C3’H位于质体，利用质体醌或者铁氧化还原蛋白为电子供体。也有人认为3号碳原子的羟化反应是由P450以香豆酰奎尼酸或者香豆酰莽草酸为底物催化的。被子植物C3’H属于细胞色素P450 CYP98家族，其催化的羟化反应不能以香豆酸单体为底物，只能催化香豆酰与莽草酸或者奎尼酸形成的复合物。拟南芥中C3’H功能丧失导致植株矮小，且高度不育，表明C3’H在植物苯丙氨酸代谢途径中是必需的。 

尽管目前已经在许多物种中克隆到p-香豆酰酯3’-羟化酶基因，但是对于忍冬科植物金银花来说该基因的克隆、功能验证尚未见报道，并且对于该基因与绿原酸关系的研究也是未见报道。 

发明内容

本发明的目的是提供一种金银花中绿原酸相关基因——p-香豆酰酯3’-羟化酶基因LjC3’H及其在制备绿原酸中的应用。 

本发明的技术方案是：从金银花中分离得到p-香豆酰酯3’-羟化酶基因LjC3’H，在原核系统中验证功能，然后在原植株中研究其与绿原酸生物合成的关系。 

本发明所述的金银花p-香豆酰酯3’-羟化酶基因LjC3’H，其特征在于：所述基因cDNA序列如SEQ ID No.1所示。