[发明专利]一种利用探针熔解技术准确检测KRAS基因突变的方法

权利要求书

1.一种利用探针熔解技术准确检测KRAS基因突变的方法，包括以下步骤：

（1）分子信标探针和模板扩增引物的设计及合成

上游引物(22nt):

5’-CAGACTGTGTTTCTCCCTTCTC-3’

延伸阻滞引物(36nt):

5’-taAGGTCAAGAGGACTCATGTACTGGTCCCTCATTG-3’

分子信标探针(34nt):

FAM-acgcATTGTACTCCTCTTGACCTGCTGTatgcgt-BHQ2

（2）提取被测样本的基因组DNA；

（3）配制反应体系

在反应管中加入被测样本的基因组DNA、上游引物、延伸阻滞引物、UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)、5’→3’外切酶活性缺失聚合酶(TIANNIUM^TM Taq DNA Polymerase)，dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸)、dUTP(脱氧尿苷三磷酸)、分子信标探针、10×PCR Buffer(TIANNIUM^TM Taq PCR Buffer)；

（4）PCR反应

将配制好的反应体系在荧光实时定量PCR仪上进行扩增和熔解，PCR反应完成后进行熔解曲线分析，通过熔解峰的Tm值判断出被测样本中是否发生了KRAS突变。

2.根据权利要求1所述的利用探针熔解技术准确检测KRAS基因突变的方法，其特征在于：

以单管反应体系25μl计，反应管中加入上游引物600nM，延伸阻滞引物60nM，UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)0.2U，5’→3’外切酶活性缺失聚合酶(TIANNIUM^TM Taq DNA Polymerase)0.5U，dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸)200μM，dUTP(脱氧尿苷三磷酸)400μM，分子信标探针250nM，10×PCR Buffer(TIANNIUM^TM Taq PCR Buffer)2.5μl，ddH2O补足体积25μl。

3.根据权利要求2所述的快速检测KRAS基因突变的方法，其特征在于：

PCR反应参数设置如下：50℃，2~5min；95℃，12~15min；95℃，1~5sec；56℃，0~1sec；65℃，0~1sec；60~70个循环；熔解:95℃，1~5min；50℃→72℃每秒收集荧光15~20次，0.02~0.05℃梯度升温。