[发明专利]一种与人表皮生长因子受体III型突变体特异性结合的核酸适配子及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种与人表皮生长因子受体III型突变体特异性结合的核酸适配子及其应用。

背景技术

近年来，已经对用于癌症诊断和治疗的一些生物标记物进行了研究。其中，癌细胞特异性的膜蛋白被认为是最适当的生物标记，因为它们常以可检测的量脱落到体液中，且体液的临床表现通常优于活检取样的侵入性方法。除此之外，膜蛋白还由于它们在癌组织成像和靶向治疗策略中的潜在用途而备受关注。

同时，生物标记鉴定领域主要依赖于双向电泳（2D-GE）和质谱分析。然而，用这种技术来阐明膜蛋白却有相当多的限制。只有30%的总细胞蛋白来自细胞膜且这当中只有5%可用2D-GE进行检测。因此，作为另一种选择，已经开发出膜蛋白的特异性探针作为鉴定所结合的靶标的工具。

过去的二十年中，具有高亲和力及特异性结合靶标蛋白的核酸探针—适配子（aptamer）领域有了新发展。具体地，为一些疾病的病变细胞相关蛋白开发了适配子，这些适配子是用SELEX（指数富集配基的系统进化）技术分离的，且它们中有许多目前正处于临床试验阶段，这些适配子本身作为治疗的一部分或作为成像或药物递送的工具、（Magalhaes et al.2012）、（Lee et al.2006）、（Gilbert et al.2007）。

除了经典的SELEX技术外，用细胞SELEX（Cell-SELEX）技术可筛选针对活细胞和组织等复杂靶标的适配子（Shangguan et al.2006）。Cell-SELEX技术的优势在于即便是未知的细胞或组织表面标记靶标，也可开发用于疾病细胞的适配子。此外，Cell-SELEX技术比以前的SELEX方法更有优势，因为靶标蛋白处于分离状态下时不能显示它们的原有特性，在筛选过程中，处于生理状态下的靶标蛋白的功能性较好，因此，用Cell-SELEX法首先开发了肌腱蛋白-C的ssDNA适配子（Daniels et al.2003），然后也开发了针对CCRF-CEM细胞（T细胞性急性淋巴细胞性白血病前体细胞）的PTK7（蛋白酪氨酸激酶）适配子以及针对小肺癌细胞的DNA适配子（Chen et al.2008）。用消减SELEX技术筛选了针对HnRNPA1的BC15适配子，可特异识别HnRNP表达的乳腺癌细胞，从而可用于临床诊断（Li et al.2009），

越来越多的研究者用Cell-SELEX技术筛选出来有价值的适配子（Hu et al.2012；Kang et al.2012）、（Zhou et al.2011）、（Bayrac et al.2011）。然而，因为细胞表面蛋白的复杂性，Cell-SELEX技术需要经过优化和特异筛选过程来进行限制性控制。因此，适当的引入阴性筛选过程对Cell-SELEX筛选的成功是至关重要的。

恶性胶质瘤（GBM）是一种常见的神经系统肿瘤，其在成人脑肿瘤中占25%(Montgomery RB,et al.J Biol Chem.2000)。这是中期生存率低、侵袭性强的恶性肿瘤（Lammering G,et al.Oncogene.2003；Heimberger AB,et al.Clin Cancer Res.2005)。由于颅内肿瘤的特性，手术切除危险性高，肿瘤浸润生长，清除不彻底；而化疗药物进入大脑又受血脑屏障的阻碍，药物进入大脑后，如何定位于肿瘤组织，这是化疗所面临的一个主要问题。据研究，表皮生长因子受体（EGFR）在多数肿瘤中存在高表达，并且存在诸多突变体，而突变体的存在使得肿瘤的致瘤性、侵袭性增强。在35%-65%的恶性胶质瘤中存在人表皮生长因子受体III突变体（EGFRvIII）的过表达（Lo HW.Curr Mol Pharmacol.2010，Tabatabai G， et al.Discov Med.2011），而且正常人不表达EGFRvIII，使得EGFRvIII成为胶质瘤治疗的一个很好的靶标。尽管目前EGFR已经作为一个生物靶标，开发出了大量的EGFR抑制剂用于肿瘤的治疗，然而，鉴于EGFR在正常细胞中也有表达，导致其副作用大，用药时间增长时，出现耐药性，开发新的特异性靶标迫在眉睫。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种与人表皮生长因子受体III型突变体（EGFRvIII）特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物。