[发明专利]一种筛选产生淀粉糖化酶菌株的方法

说明书

技术领域

本发明属发酵工程领域，涉及一种菌种的筛选方法，具体的说，涉及一种筛选产生淀粉糖化酶菌种的方法，是一种将生淀粉进行化学灭菌后添加到筛选培养基中，再通过透明圈法鉴别生淀粉糖化酶活性强的菌株的方法。

背景技术

淀粉广泛用于制药、制酒和有机酸等加工产业。传统的加工工艺是先将淀粉糊化，然后用糖化酶将淀粉降解为葡萄糖，用于后续的发酵加工。生淀粉糖化酶（Raw starch-digesting Glucoamylase，RSDG）能以没有加热糊化的生淀粉为底物，从淀粉非还原性末端依次水解α-1，4糖苷键得到一个个葡萄糖单元分子，省去加热糊化步骤，达到简化工艺、降低能耗的作用。目前，关于生淀粉糖化酶菌株筛选的报道有很多，但生淀粉糖化酶菌株的筛选方法单一，主要采用碘显色反应检验水解圈进行筛选，该方法需要对整个平板染色（加碘液）以便识别生淀粉糖化酶菌株。由于碘对菌株有强烈的杀害作用，不利于后续分离纯化，因此常采用先纯化保存再检测的方法，操作较为繁琐。也有报道利用碘的挥发特性，采用碘熏蒸代替碘液检验水解圈再分离纯化，但是不同的菌株碘熏量和时间不同，不易操作。另外，也有报道利用甲醛气体熏蒸生淀粉灭菌24 h，再用105 ℃干热灭菌2 h，用于配制生淀粉糖化酶筛选培养基，但该方法较为费时，而且使用了高温处理，处理不好可能使淀粉熟化，同时，由于甲醛气体强烈刺激粘膜、具有致癌性、操作必须谨慎。

发明内容

本发明的目的是提供一种筛选产生淀粉糖化酶菌种的方法，利用糖化酶产生菌可以在筛选培养基上形成透明水解圈，可以直接从平皿上观测，不需要滴加碘液染色，菌落可以直接挑出纯化进入后续研究过程。

本发明所采用的技术方案：

一种筛选产生淀粉糖化酶菌种的方法，其步骤如下：

1、取不溶性生淀粉进行消毒灭菌。

所述不溶性生淀粉的消毒灭菌方式是利用次氯酸钠溶液对不溶性生淀粉消毒灭菌。

所述不溶性生淀粉的消毒灭菌方式是利用升汞溶液对不溶性生淀粉消毒灭菌。

所述不溶性生淀粉的消毒灭菌方式是利用双氧水溶液对不溶性生淀粉消毒灭菌。

2、配制筛选培养基

平皿筛选培养基的配方为：NaNO₃ 0.1～0.5%、K₂HPO₄ 0.1～0.3%、MgSO₄·7H₂O 0.03～0.1%、KCl0.03～0.1%、FeSO₄·7H₂O0.001～0.003%、琼脂粉1～3%，pH=5.5～7.5，高温灭菌。待培养基冷却到60～85℃时，加入经过灭菌的不溶性生淀粉，使不溶性生淀粉的浓度达到1～3%，迅速倒平皿。

3、从田间收集腐烂木薯、其他植物组织或土样，用无菌水浸提，稀释后涂布在平皿筛选培养基上，25～40℃下培养2～3天，挑取生长旺盛、水解透明圈明显的菌落分离纯化，再接种平板分离培养基中25～40℃培养2～3天，验证透明圈。验证方式采用滴加碘液检验方式，即在部分平皿中用传统方法滴加碘液检验透明圈是否与传统的染色圈一致。

作为优选，在平皿筛选培养基涂布前采用富集培养方式，即取腐烂木薯、其他植物组织或土样，表面消毒后加入摇瓶富集培养基中，25～40℃，100～400 r/min培养2～5天，取培养液稀释后加入平皿筛选培养基中涂布。所述摇瓶富集培养基的配方为：NaNO₃ 0.1～0.5%、K₂HPO₄ 0.1～0.3%、MgSO₄·7H₂O 0.03～0.1%、KCl 0.03～0.1%、FeSO₄·7H₂O 0.001～0.003%、pH=5.5～6.0，高温灭菌后加入经过灭菌的不溶性生淀粉，使不溶性生淀粉的浓度达到1～3%。

4、将分离纯化的菌株进一步培养，优化产酶条件，测定酶学特性。

本发明利用糖化酶产生菌可以在筛选培养基上形成透明水解圈的特性，不需要滴加碘液染色，不需要先保存大量菌株再进行筛选，可以直接从平皿上挑出菌落进行纯化进入后续研究过程，操作简单，安全。

附图说明

图1：用不同灭菌溶液处理生淀粉所配制的筛选培养基的灭菌效果；

A：用75 %酒精灭菌的生淀粉所配制的培养基，在28℃培养5天，长出菌落，说明灭菌不彻底；