[发明专利]一种可同时识别OdDHL和BHL的核酸适体及其应用

说明书

（一）技术领域：

本发明涉及生物技术领域，具体涉及利用分子生物学技术筛选到一种可同时识别N-(3-氧化十二烷酰基)-L-同型丝氨酸内酯[N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone，OdDHL]和N-丁酰高丝氨酸内酯（N-butanoyl-L-homoserine lactone，BHL）的核酸适体及其应用，即一种可同时识别OdDHL和BHL的核酸适体及其应用。

（二）背景技术：

铜绿假单胞菌（Pseudomonase aeruginosa，PA）是临床上最常见的一种非发酵革兰氏阴性致病菌。它对临床上应用的大部分抗生素都具有较强的耐药性，而且其耐药性的发展速度非常快，极易对新型抗生素产生耐药性，这极大地影响了其感染的治疗。

研究表明，铜绿假单胞菌产生的各种严重感染与其毒力因子的释放密切相关，而铜绿假单胞菌的绝大部分毒力因子的表达都受其群体效应系统（quorum sensing，QS）的正性调控。N-(3-氧化十二烷酰基)-L-同型丝氨酸内酯（N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone，OdDHL）和N-丁酰高丝氨酸内酯（N-butanoyl-L-homoserine lactone，BHL）分别是铜绿假单胞菌群体效应系统的las和rhl信号途径的信号分子。铜绿假单胞菌在生长过程中，不断向细胞外分泌这两种信号分子。当细菌周围环境中的信号分子浓度达到阈值时，便可激活这两个信号途径，从而启动铜绿假单胞菌毒力基因的表达，增强铜绿假单胞菌的致病性。研究发现，干扰铜绿假单胞菌的群体效应系统可以抑制细菌毒力，降低其致病性，具有治疗感染的作用。

目前，国外已经报道了一类可以与OdDHL结合的鼠源性单克隆抗体，亲和力在5nM～150nM之间。这类抗体在体外实验中可结合OdDHL分子，干扰铜绿假单胞菌的QS系统的信号转导，从而可抑制细菌毒力的表达。然而，这类抗体虽然具有治疗铜绿假单胞菌感染的潜在价值，但是这种抗体只能结合OdDHL和BHL两种分子中的一种，不能完全阻断PA的QS系统的激活，因而阻断PA毒力的表达的效果有限。此外，由于鼠源性抗体对人类来说是一种异种蛋白，如果直接将OdDHL的鼠源性单克隆抗体应用于人体的治疗，人体可产生针对鼠抗的抗体（人抗鼠反应），从而与抗体结合并清除鼠抗，降低其的疗效。而且，直接应用鼠源性抗体还可能会诱发过敏反应，对患者造成损伤。由此，鼠源性抗体需要通过人源化改造后才能应用于人体，但是，鼠源性抗体的人源化改造是一个复杂、费时的过程，对技术要求相当高，而且在改造过程中容易导致抗体亲和力降低，甚至完全丧失，这导致鼠源性抗体应用于治疗的开发逐渐被放弃。

与抗体相比，核酸适体是通过体外筛选技术SELEX(指数富集配体系统进化)从DNA/RNA文库中筛选出来的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的单链寡聚核苷酸片段（ssDNA或ssRNA），它具有高特异性和亲和力识别其靶标分子，一些与疾病密切相关的生长因子、酶、受体等物质均能成为核酸适体的靶标，而且其化学性质稳定，因此，亟需要研究和发展能够特异性抑制铜绿假单胞菌毒性的核酸适体，从而为疾病治疗的临床应用奠定基础。

（三）发明内容：

本发明的目的在于提供一种可同时识别OdDHL和BHL的核酸适体及其应用，它能够解决现有技术的不足，提供一种易于制备、节约成本、安全性好的能够与OdDHL和BHL均发生高亲和力和高特异性结合的核酸适体，以及上述核酸适体在制备抑制铜绿假单胞菌毒性的试剂中的应用。

本发明的技术方案：一种可同时识别OdDHL和BHL的核酸适体，其特征在于：所述核酸适体的核苷酸序列为GCAATGGTACGGTACTTCCTGTGGGTTAGTTTGACTCAAGGCTGGGCTTATACAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA。

所述核酸适体的应用，其特征在于：用于干扰铜绿假单胞菌的群体效应系统的las和rhl信号途径，抑制群体效应系统调控的毒素分泌以及生物膜的形成，抗铜绿假单胞菌感染。

所述核酸适体的筛选方法，其特征在于它由以下步骤构成： 

1、 OdDHL类似物与载体的偶联：