[发明专利]检测自身免疫性疾病抗体的免疫印迹试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测多种自身免疫性疾病相关抗体的免疫印迹试剂盒，还涉及该免疫印迹试剂盒的制备方法及使用方法，属于生物医学领域。

背景技术

自身免疫性疾病（autoimmune diseases）是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病，WHO（World Health Organization，世界卫生组织）曾指出其患病人数在占总人群的3~5%，据权威统计，我国自身免疫性疾病患者的发病率在6000万人以上。自身免疫性疾病好发于女性和中老年人，其特点是起病缓慢，病程长且反复发作，疾病的中晚期对健康危害很大，患者的生活质量低，疗效差，早期诊断有助于自身免疫性疾病的临床控制。

许多自身抗体在相关疾病的发病前一段时间就可从血清中检测到。几十年来，免疫学研究已经发现多数自身免疫性疾病患者血清中存在着特异性自身抗体，例如系统性红斑狼疮的抗Sm抗体和抗dsDNA抗体，类风湿关节炎的抗CCP抗体，干燥综合征的抗SSA抗体和抗SSB抗体，Ⅰ型糖尿病的抗GAD抗体、抗ICA抗体和抗IA-2A抗体，自身免疫性甲状腺疾病的抗TG抗体、原发性胆汁性肝硬化的抗AMA-M2抗体，许多特异性自身抗体是自身免疫性疾病诊断标准中重要的组成部分。

系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、干燥综合征、Ⅰ型糖尿病、自身免疫性甲状腺疾病、原发性胆汁性肝硬化等是常见的自身免疫疾病，其临床表现的特点往往被患者忽视，因此，需要定期进行体检筛查。目前，国内外临床检验领域已有少数用于单一自身免疫性疾病相关抗体检测的免疫印迹产品，但尚无用于多种自身免疫性疾病体检筛查的免疫印迹产品。已有免疫印迹试剂基本采用SDS-PAGE技术将抗原按分子量大小转移到印迹膜上，在此过程中许多抗原决定簇的构象可能遭到破坏，不能与临床样本中的特异性抗体发生结合或发生非特异性结合，造成结果判断错误。并且，现有产品质控体系不完善，不便于操作者对显色结果进行快速、直观、准确的判断。

发明内容

综上所述，本发明的目的在于针对目前尚无用于多种自身免疫性疾病体检筛查的免疫印迹产品，以及已有的免疫印迹试剂存在上述不足，而提出的一种检测自身免疫性疾病抗体的免疫印迹试剂盒及其制备方法。 

为实现本发明的目的，采用如下的技术方案：

检测自身免疫性疾病抗体的免疫印迹试剂盒，包括：反应膜条、酶结合物、显色底物、洗涤液、样本稀释液和终止液，其特征在于：所述的反应膜条由载体和固定在载体上的硝酸纤维素膜或尼龙膜所组成，在所述的硝酸纤维素膜或尼龙膜上含有：分别由dsDNA、Sm/RNP、CCP、SSA、SSB、GAD、ICA、IA-2A、TG、AMA-M2共10种中的至少两种天然或重组抗原包被而成的两条以上平行的检测线，1条包被浓度为30-50 μg/ml的高浓度质控带，1条包被浓度为15-25 μg/ml的中浓度质控带，及1条包被浓度为1-10 μg/ml的低浓度质控带。 

所述的载体为双面粘性的PVC板，正面与所述的硝酸纤维膜或尼龙膜固定粘接，背面固定粘接有透明的PET底衬板。

所述的高浓度质控带、中等浓度质控带和低浓度质控带由人IgG，或抗鼠IgG或抗羊IgG划线而成。

所述的酶结合物为辣根过氧化酶标记的鼠抗人IgG；所述的显色底物为四甲基联苯胺；所述的洗涤液为20×Tris缓冲液；所述样本稀释液为含封闭剂的Tris缓冲液；所述的终止液为0.1M/L硫酸。

制备所述试剂盒的方法，包括有反应膜条制备方法，其特征在于所述反应膜条制备方法包括有以下步骤：

1）配制点样溶液：将dsDNA、Sm/RNP、CCP、SSA、SSB、GAD、ICA、IA-2A、TG和AMA-M2抗原，及人IgG、抗鼠IgG或抗羊IgG配制成相应的包被浓度；

2）固定抗原：根据免疫印迹点样器的大小，将硝酸纤维膜或尼龙膜裁成膜片，通过物理吸附和共价结合的方式，将1）中配置好的点样溶液以一定的排列次序固定在膜片上，形成独立的检测线；

3）封闭：将膜片放在无关蛋白或血清的溶液中对其非点样部位进行封闭，所述的无关蛋白或血清包括脱脂奶粉、酪蛋白、牛血清白蛋白、饱和赖氨酸和小牛血清；

4）干燥：将封闭好的膜片条放入37℃恒温箱中干燥2小时；

5）贴膜：将干燥好的膜片贴于双面粘性的PVC板的正面，PVC板的背面待用；

6）切膜：将5）中贴好的膜片按照独立检测线切成一定宽度的条带；

7）组装：通过模具，将6）中的条带按次序贴于透明的PET底衬板上；