[发明专利]一种纳米磁微粒与抗体偶联的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种纳米磁微粒与抗体偶联的方法。背景技术

磁性分离技术是以纳米或微粒级的磁性微粒为载体，利用结合于磁性微粒表面的蛋白质所提供的特异的亲和特性，在加磁场的定向控制下，通过亲和吸附、清洗、解吸操作，可以进一步从复杂的生物体系中分离到目标物分子，具有磁性分离简单方便、亲和吸附高特异性及高敏感性等众多优点。应用于磁性分离技术的磁性载体应具备以下特点：①粒径比较小，比表面积较大，具有较大的吸附容量；②物理和化学性能稳定，有较高机械强度，使用寿命长；③含有可活化的反应基团，以用于亲和配基的固定化；④粒径均一，能形成单分散体系；⑤悬浮性好，便于反应的有效进行。

纳米技术的出现，促进了磁性微粒的应用。纳米磁微粒粒径小，加至反应液中呈悬浮状态，加磁场后可迅速分离。纳米磁微粒还可通过免疫反应与标记有荧光素、化学发光物质、酶等物质连接，建立各种免疫分析方法。

纳米磁微粒化学发光免疫诊断试剂综合采用了目前国际上的两大主流免疫分析尖端技术——悬浮纳米磁微粒载体技术、化学发光检测技术，能够准确定量的检测人类血清中的免疫抗原或抗体，可用于过敏、自身免疫、甲状腺功能、肿瘤、性激素、传染病等相关标志物的检测。然而，不同的纳米磁微粒和抗体的偶联方法，会导致偶联上抗体活性的不同，影响试剂的灵敏度。现有技术中，纳米磁微粒和抗体偶联过程中偶联剂和抗体易接触导致抗体活性下降，试剂的灵敏度较低。因此，开发一种纳米磁微粒和抗体的偶联方法，保证抗体偶联到纳米磁微粒上后保持较高的活性，确保试剂的灵敏度，是该平台发展的核心技术之一。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种纳米磁微粒与抗体偶联的方法，以解决纳米磁微粒包被抗体后活性下降，试剂灵敏度低的问题，提高纳米磁微粒化学发光免疫诊断试剂的灵敏度。

为了达到上述目的，本发明提供一种纳米磁微粒与抗体偶联的方法，其特征在于，具体步骤为：

（1）取含有磁微粒的悬浮液，磁分离去上清，用2-吗啉乙磺酸（MES）缓冲液重悬；

（2）加入新鲜配制的碳二亚胺（EDC）水溶液，室温混悬；

（3）磁分离去上清，加入2-吗啉乙磺酸缓冲液重悬；

（4）加入抗体，室温混悬；

（5）磁分离，去上清，用磁微粒保存液重悬。

较佳地，所述步骤（1）和（2）中，所述的2-吗啉乙磺酸缓冲液为2-吗啉乙磺酸的摩尔含量为0.05mol/L，pH4~6的2-吗啉乙磺酸缓冲液。

较佳地，本发明提供一种纳米磁微粒与抗体偶联的方法的具体步骤为：

（1）取含有100mg磁微粒的悬浮液，磁分离去上清，用0.05mol/L，pH4~62-吗啉乙磺酸缓冲液10ml重悬；

（2）加入0.5~2ml新鲜配制的10mg/ml的碳二亚胺水溶液，室温混悬；

（3）磁分离去上清，加入0.05mol/L,pH4~62-吗啉乙磺酸缓冲液10ml重悬；

（4）加入4mg的抗体，室温混悬；

（5）磁分离，去上清，用磁微粒保存液重悬到1mg/ml。

较佳地，所述的磁微粒为表面带有羧基的纳米磁微粒，直径200纳米至3微米。

较佳地，所述的抗体为多克隆抗体或者单克隆抗体，纯度为90wt%以上。

较佳地，所述步骤（2）和（3）中，室温温悬的时间为1～5h。

相较于现有技术，本发明提供的纳米磁微粒与抗体偶联的方法，以两步清洗偶联法将纳米磁微粒与抗体偶联，避免了偶联过程中偶联剂EDC和抗体接触导致抗体活性下降的缺陷，本发明的方法简单，成本低，可用于纳米磁微粒和多种抗体的偶联，解决了纳米磁微粒偶联抗体后，抗体活性下降导致试剂灵敏度低的问题。

附图说明

图1为本发明实施例一中AFP试剂的灵敏度评价拟合曲线。

图2为本发明实施例二中AFP试剂的灵敏度评价拟合曲线。

图3为本发明实施例三中AFP试剂的灵敏度评价拟合曲线。

具体实施方式

以甲胎蛋白（AFP）单克隆抗体偶联的纳米磁微粒化学发光测试试剂为例，将AFP单抗和纳米磁微粒采用以下方法偶联。使用市售的Maglia60化学发光免疫分析仪测定AFP试剂的灵敏度。

其中，所述的甲胎蛋白单克隆抗体偶联的纳米磁微粒化学发光测试试剂（APF试剂）包括：含有荧光素（FITC）标记的AFP抗体的溶液（简称第一试剂）和包被有荧光素抗体的磁微粒的悬浮液（简称磁分离试剂），以及碱性磷酸酶（ALP）标记的AFP抗体的溶液（简称第二试剂）。